石甘散聯合托吡酯對癲癇幼鼠認知功能及海馬組織CB2R、MDA、SOD水平的影響

楊昕憓，于 濱

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院神經內科 150000)

癲癇是一類由已知或未知病因所致的腦部神經元過度同步化放電為特征的發作性腦病。目前醫學上關于癲癇的發病機制尚無統一定論[1-2]。已有研究證實，氧化應激所致的后續反應可能在癲癇的發生、發展中扮演著重要角色。氧化應激產物自由基的過度表達可對蛋白質等大分子物質造成損傷，進而破壞細胞結構，引起細胞凋亡[3-5]。因此如何抑制癲癇患者發病或產生的氧化應激反應是治療癲癇的關鍵所在。托吡酯為一類廣譜抗癲癇藥物，已被證實對多種類型癲癇均具有較好的治療效果，并可作為一線抗癇藥物單獨或與其他藥物聯合使用[6-7]。中醫藥為我國傳統醫學范疇，其具有毒副作用小、療效顯著等特點，已廣泛運用于臨床中，而石甘散是有石菖蒲和甘松組成的抗癇藥物，臨床效果顯著[8-9]。基于此，本研究通過探討石甘散聯合托吡酯對癲癇幼鼠認知功能及海馬組織大麻素受體2(CB2R)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平的影響，旨在為臨床上治療癲癇提供相關依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

選取60只10日齡SD大鼠，體重為25～35 g，購于河南省實驗動物中心[動物許可證：SCXK-(豫)2019-017]。于屏障環境下飼養1周后開始實驗，將60只SD大鼠分為對照組、模型組、石甘散組、托吡酯組、聯合組，每組12只。

1.1.2主要儀器試劑

托吡酯(西安楊森制藥有限公司，國藥準字：H20020555，每片25 mg)；石甘散：由石菖蒲、甘松按1∶1比例進行配置；戊四氮、SOD試劑盒、MDA試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；CB2R兔多克隆抗體、兔抗GADPH(武漢博士德生物工程有限公司)；ECL高效化學發光試劑盒(美國Genview公司)；蛋白提取試劑盒(寶生物工程有限公司)。Bio Rad 450酶標儀(美國Bio Rad公司)；JY-SCZ2型十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1建模

對照組腹腔注射1 mL的0.9%氯化鈉溶液，連續注射28 d。其余4組均于每日固定時間腹腔注射戊四氮溶液(實驗前30 min將300 mg戊四氮晶體溶于150 mL的0.9%氯化鈉溶液)，連續注射28 d，以RACINE[10]制訂的分級法為評斷標準，當SD大鼠出現5次級以上Ⅱ級及以上癥狀即為癲癇模型構建成功。

1.2.2干預

對照組及模型組給予0.9%氯化鈉溶液(10 mg/kg)灌胃，每日2次，連續28 d。石甘散組給予1 g/kg石甘散灌胃，每日1次，托吡酯組給予18 mg/kg托吡酯灌胃(使用前，以0.1 mg托吡酯：0.1 mL的0.9%氯化鈉溶液比例進行稀釋)，每日1次，聯合組給予1 g/kg石甘散和18 mg/kg托吡酯灌胃，每日1次，連續干預28 d。

1.2.3認知功能評價

水迷宮實驗：水迷宮由直徑為1.3 m，高0.5 m的圓形蓄水池及透明玻璃構成，水深0.3 m。實驗期間水迷宮周圍參照物擺放順序無變動，水溫為室溫。在測試前1 d，水池內不放平臺，讓大鼠于池中自由游泳120 s，讓其熟悉周圍環境，此階段持續5 d后開始測試。定位航行實驗：放置平臺，第1～4天每日上午及下午固定時間按照東北、西北、西南、東南4個象限將大鼠面向池壁完全浸入水中，記錄其從入水到找到平臺時間。若120 s內未找到平臺則引導其找到平臺，搜索時間記為120 s。所有大鼠在找到平臺后均保持在臺上30 s，讓其熟悉周圍參照物。空間探索時間：第5天撤掉平臺，將大鼠頭向東北迷宮壁的中點浸入水中，記錄大鼠在120 s內穿越原平臺次數及在原平臺處探索時間，并計算百分比。

1.2.4CB2R、MDA、SOD水平檢測

水迷宮實驗結束后立即處死大鼠，并提取海馬組織。冰浴條件下超聲震碎制成10%組織勻漿液，并于4 ℃、3 000 r/min條件下離心10 min,采用考馬斯亮藍檢測法測定海馬組織MDA及SOD水平。取海馬組織，根據蛋白提取試劑盒提取總蛋白并測定濃度。根據Western blot試劑盒說明書進行電泳、轉膜、封閉，采用1∶300比例稀釋后的兔抗CB2R孵育過夜。次日TBST洗滌后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗，孵育2 h后，進行成像，并采用Image J軟件進行灰度值分析。根據內參標準計算目標條帶相對值，判斷蛋白相對表達量。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 水迷宮結果

第1～4天，5組在同一時間點找到平臺時間由高到低分別為模型組、石甘散組、托吡酯組、聯合組、對照組。撤掉平臺后，穿越原平臺位置次數及在平臺象限搜索時間所占百分比由低到高分別為模型組、石甘散組、托吡酯組、聯合組、對照組，見表1、2。

表1 各組大鼠搜索平臺時間

表2 各組大鼠穿越平臺時間及在原平臺象限搜索時間所占百分比

2.2 腦組織MDA及SOD水平比較

各組MDA水平由高到低分別為模型組、石甘散組、托吡酯組、聯合組、對照組，而SOD水平由低到高分別為模型組、石甘散組、托吡酯組、聯合組、對照組，見表3。

表3 各組腦組織MDA及SOD水平比較

2.3 海馬組織CB2R蛋白水平比較

各組CB2R蛋白水平表現分別為模型組(0.39±0.09)、聯合組(0.30±0.06)、石甘散組(0.20±0.05)、托吡酯組(0.19±0.05)、對照組(0.13±0.04)，模型組與其他各組比較差異有統計學意義(P<0.05)；石甘散組與對照組及聯合組比較差異有統計學意義(P<0.05)；托吡酯組與對照組及聯合組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 海馬組織CB2R蛋白Western blot結果

3 討 論

流行病學資料顯示，世界范圍內癲癇發病率約為5%，且是兒童時期最為常見的慢性神經系統疾病之一，高發于出生后的第一年[11]。大部分癲癇兒童的智力無明顯異常，但有部分患兒會表現為暫時或永久性的認知損傷，這將嚴重影響患兒的生活質量及身心健康。研究認為，導致癲癇患兒認知功能的主要因素包括引起癲癇發作的神經病理因素，其次為癲癇的發作形式、社會心理因素及抗癲癇藥物，上述因素相互作用導致患兒的認知功能障礙[12-13]。抗癇藥物為目前臨床上治療癲癇的主要方式，其具有應用范圍廣、使用時間長等特點，而單藥或多藥物的長期應用導致抗癇藥物對患者，特別是大腦處于發育期的患兒認知功能的影響則是臨床工作者及家長的關注重點。

托吡酯是一種新型抗癇藥物，其發揮作用的主要機制包括以下幾個方面[14]：(1)通過γ-氨基丁酸(GABA)受體作用，從而對GABA介導的神經抑制作用產生促進作用；(2)對電壓依賴性鈉離子通過產生阻斷作用；(3)調節谷氨酸水平從而調節離子通道；(4)對部分電壓門控及鈣門控鉀離子通道內流具有增強作用。有研究發現，托吡酯對正常幼鼠的認知功能無影響，而對癲癇幼鼠的認知功能具有一定的改善作用[15]。而也有研究發現，托吡酯對癲癇患者的運動力、注意力等方面產生負面影響[16]。石甘散屬我國傳統醫學范疇，由石菖蒲及甘松組成。研究發現，石甘散可改善戊四氮所致的癲癇大鼠海馬組織中的谷氨酸、GABA水平，從而調節離子通道，抑制神經元放電，最終保護腦細胞，發揮抗癇的作用[17]。現代藥理學研究表明，石菖蒲含有氨基酸、有機酸、揮發油等成分，具有抗驚厥、鎮靜、腦保護及益智等作用[18]。而甘松發揮藥效的主要成分為甘松新酮，并具有改善認知功能、保護腦神經及鎮靜等作用[19]。基于此，本研究探討了石甘散聯合托吡酯對癲癇幼鼠認知功能的影響。結果顯示，單獨用藥或聯合用藥均可改善癲癇幼鼠的認知功能，且石甘散聯合托吡酯治療對幼鼠的認知功能改善效果更為明顯。

氧化應激及其所致的神經細胞凋亡是誘發并導致癲癇反復發作的主要原因，其主要機制為活性氧簇ROS的過度表達從而增加了細胞間的鈣離子濃度，進而導致腦部神經元的重塑、壞死及凋亡[5]。SOD為機體內超氧化物酶，具有清除自由基、還原有毒過氧化物的作用；MDA是脂質發生氧化應激的終產物，具有細胞毒性，二者在癲癇的發生、發展中均發揮著重要作用。內源性大麻素系統在中樞神經系統中起著重要作用，而CB2R為內源性大麻素受體之一，主要表達于外周免疫細胞。近年來，隨著研究的深入，發現CB2R在中樞神經系統中的特定區域也有所表達。有研究發現，在毛果蕓香堿誘導的癲癇大鼠模型慢性期中，大麻素可改善大鼠的癲癇行為，并通過對神經元自噬作用激活從而產生抗氧化作用[20]。本研究結果顯示，單獨用藥或聯合用藥均可改善癲癇幼鼠的腦組織MDA、SOD及海馬CB2R水平，且石甘散聯合托吡酯治療對幼鼠的各指標改善效果更為明顯，提示可抑制癲癇幼鼠的氧化作用。

綜上所述，石甘散聯合托吡酯可顯著改善癲癇幼鼠認知功能，并提高海馬組織SOD活性及CB2R水平，降低MOD含量，抑制氧化反應，減輕自由基對腦組織的損傷。