miR-4458靶向STAT3對結直腸癌細胞增殖、凋亡及上皮間質轉化的影響*

顏 超，趙 強

(四川省德陽市第二人民醫院普外科 618000)

結直腸癌(CRC)是全球癌癥相關發病率和病死率高的主要原因[1-2]。此外，大部分CRC患者初次診斷時即為晚期，且具有高轉移性和復發性，嚴重威脅人類的生命健康，因此探索新的生物標記物用于改善臨床CRC診斷和治療效果至關重要[3]。細胞侵襲和遷移行為是影響腫瘤轉移的重要因素，而靶向驅動調控基因可能是治療惡性腫瘤疾病并提高生存率的理想策略[4]。微小RNA(miRNA)是內源性非編碼小RNA，可以在轉錄水平上調節靶mRNA表達，參與疾病發展進程[5]。QIN等[6]研究發現，miR-4458在結腸癌細胞被下調，過表達miR-4458可以抑制細胞增殖、糖酵解和乳酸形成，但miR-4458對結腸癌細胞凋亡、侵襲和遷移影響及其作用機制尚未闡明。本研究旨在探索miR-4458過表達對CRC細胞系人結腸癌細胞(HT-29)凋亡、侵襲、遷移及上皮間質化(EMT)影響，并初步探索其作用機制，以期為開發CRC臨床診斷和治療新方法提供思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1主要材料

人結腸癌細胞(HT-29，TCHu103)和人正常結腸上皮細胞(HCoEpiC，C1388)購于中國科學院細胞庫；miR-4458 mimics、miR-4458 NC由廣州市銳博生物科技有限公司設計合成；miR-4458、STAT3、U6、GADPH引物序列由上海生工生物工程有限公司設計合成；細胞計數試劑盒(Cell Counting Kit 8，CCK-8，CA1210)、RPMI 1640培養基(10491)、Matrigel膠(356234)、Trizol試劑盒(15596-018)、RIPA裂解液(R0010)、ECL發光液(PE0010)購于北京Solarbio公司；胎牛血清(C0227)、上皮型鈣粘蛋白(E-cadherin，AF0138)和波形蛋白(Vimentin)鼠抗人單克隆抗體(AF0318)、神經性鈣黏附蛋白(N-cadherin)兔抗人多克隆抗體(AF0243)購于上海碧云天公司；PureLinkTMRNA Mini試劑盒(12183025)、山羊抗兔lgG(H+L，A32731)和山羊抗小鼠lgG(H+L)二級抗體(A32723)購于美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.2主要儀器

MA100N型倒置顯微鏡由日本Nikon公司生產；ELX-8081U型酶標儀和Gel DocTMXR+型凝膠成像儀由美國Bio-Rad公司生產；5333型PCR儀由德國Eppendorf公司生產；SG160型二氧化碳細胞培養箱由江蘇博賽斯儀器制造有限公司生產。

1.1.3實驗動物

18只8周齡SPF級雌性BALB/c小鼠，體重(20.0±1.8)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號SCXK(滬)2017-0011。經本院動物倫理委員會批準，并遵守3R保護原則進行實驗。

1.2 方法

1.2.1CRC腫瘤組織

采集2019年1月1日至12月31日本院40例結腸癌患者腫瘤組織和癌旁正常組織，均儲存于液氮中。患者手術前未接受過放射療法或化學療法。該研究得到本院倫理委員會的批準。

1.2.2細胞培養

HT-29細胞和HCoEpiC細胞均接種于補充10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，于37 ℃、5%CO2環境培養，培養至3～5代，消化收集細胞，用于后續實驗。

1.2.3細胞分組及轉染

將HT-29細胞分為對照組、miR-4458陰性對照組(NC)組和miR-4458模擬物(mimics)組，按照Lipofectamine 2000說明書將miR-4458 mimics和miR-4458 NC轉染細胞6 h，對照組不做轉染處理，然后更換新鮮培養液孵育24 h，收集后用于后續實驗。另取1.2.2 HCoEpiC細胞設置為正常組。

1.2.4HE染色

將1.2.1收集的CRC癌組織和癌旁組織制成厚度為3 mm的組織切片，根據HE染色試劑盒說明書步驟對上述組織進行染色，顯微鏡下觀察組織病理狀態。

1.2.5逆轉錄定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)實驗

根據PureLinkTMRNA Mini試劑盒說明書，從冷凍組織(每個組織最多30 mg)和1.2.3各組細胞提取總RNA，分別逆轉錄后，進行PCR擴增。以U6、GADPH為內參，采用2-ΔΔCt法分別計算miR-4458和STAT3 mRNA相對表達量。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，62 ℃延伸30 s，共40次循環。其中每組細胞RNA檢測實驗設置3個復孔，實驗重復6次。miR-4458、STAT3、U6、GADPH引物序列見表1。

表1 miR-4458、STAT3、U6和GADPH引物序列

1.2.6移植瘤模型的建立

將對照組、miR-4458 NC組和miR-4458 mimics組HT-29細胞培養至對數期，調整濃度為1.8×107個/mL，分別取125 μL接種于小鼠右前肢腋下，每組6個平行，每周檢測裸鼠移植瘤瘤體大小，6周后頸椎脫臼法處死小鼠，分離皮下移植瘤，計算各組各小鼠腫瘤體積，計算平均值。各組小鼠腫瘤體積均值=長×寬×0.5/6。

1.2.7雙熒光素酶報告基因檢測實驗

經Targetscan Human數據庫預測顯示，miR-4458與STAT3 mRNA 3′UTR區有結合位點，見圖1。將含有預測的miR-4458結合位點的STAT3 3′UTR序列和突變型STAT3 3′UTR序列克隆至pGL3報告載體，得到野生型STAT3-3′UTR-WT和突變型STAT3-3′UTR-MUT質粒。取上述質粒0.5 μg，均與miR-4458 mimics、miR-4458 NC共轉染HT-29細胞24 h，分為STAT3-3′UTR-WT+miR-4458 NC組、STAT3-3′UTR-WT+miR-4458 mimics組、STAT3-3′UTR-MUT+miR-4458 mimics組和STAT3-3′UTR-MUT+miR-4458 NC組，根據說明書制備細胞提取物，測量各組熒光素酶活性，以上實驗重復6次。

圖1 miR-4458與STAT3 mRNA結合位點預測

1.2.8CCK-8實驗

參照文獻[7]方法，檢測1.2.3各組HT-29細胞在轉染6、12、24和48 h時的增殖變化情況，每組6個復孔，實驗重復6次。

1.2.9Annexin V-FITC/PI實驗

嚴格按照試劑盒說明書，對1.2.3各組HT-29細胞進行Annexin V-FITC和PI染色處理，于流式細胞儀上檢測凋亡情況，每組3個復孔，實驗重復6次。

1.2.10劃痕實驗

待1.2.3各組HT-29細胞長滿后，用200 μL槍頭垂直劃痕，記錄劃痕情況，加入含有胎牛血清的培養基培養24 h，拍照記錄各組遷移情況，分析計算遷移率。遷移率=(0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%，每組3個復孔，實驗重復6次。

1.2.11Transwell侵襲實驗

用無血清的培養基調整1.2.3各組HT-29細胞密度為1×106個/mL，取200 μL添加至含有Matrigel凝膠的上室，下室添加500 μL完全培養基，培養24 h。取出小室，固定，結晶紫染色，隨機抽取6個視野拍照并計數，每組3個復孔，實驗重復6次。

1.2.12Western blot實驗

低溫裂解各組HT-29細胞分別獲得總蛋白，并檢測蛋白濃度。經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離裂解蛋白、轉膜、封閉后，加入一抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和GADPH(1∶1 000)，孵化過夜，添加二抗(1∶5 000)，共孵育2 h，加入ECL，暗室曝光顯影，分析條帶密度進行定量分析，每組3個復孔，實驗重復6次。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 miR-4458和STAT3在CRC患者癌組織和癌旁組織的表達情況

CRC患者癌旁組織與癌組織病理檢查顯示，與癌旁組織相比，癌組織中miR-4458表達顯著降低(P<0.05)，STAT3 mRNA顯著升高(P<0.05)，見圖2。

A：癌旁組織，HE×40；B：癌組織，HE×40；C：CRC患者癌組織和癌旁組織miR-4458和STAT3表達情況與癌旁組織相比，P<0.05。

2.2 各組細胞miR-4458表達水平情況

與正常組相比，對照組miR-4458表達顯著降低(P<0.05)，STAT3 mRNA表達顯著升高(P<0.05)；與對照組和miR-4458 NC組相比，miR-4458 mimics組HT-29細胞miR-4458表達水平顯著升高(P<0.05)，STAT3 mRNA表達顯著降低，見表2。

表2 各組細胞miR-4458表達情況

2.3 雙熒光素酶報告基因檢測系統驗證miR-4458與STAT3靶向關系

雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，與STAT3-3′UTR-WT+miR-4458 NC組(0.82±0.09)比較，STAT3-3′UTR-WT+miR-4458 mimics組(0.17±0.02)熒光素酶活性降低(P<0.05)；STAT3-3′UTR-MUT+miR-4458 mimics組(0.75±0.04)和STAT3-3′UTR-MUT+miR-4458 NC組(0.71±0.05)差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 過表達miR-4458對HT-29瘤體生長的抑制作用

與對照組[(221.14±40.25)mm3]和miR-4458 NC組[(242.46±45.08)mm3]相比，miR-4458 mimics組[(29.92±5.47)mm3]小鼠HT-29移植瘤體積顯著縮小(P<0.05)，見圖3。

圖3 各組小鼠HT-29移植瘤大小(標尺：1 cm)

2.5 miR-4458 mimics轉染對HT-29細胞增殖影響

隨培養時間的延長，各組細胞的增殖活性呈時間依賴性增加趨勢；相同時間下，與對照組和miR-4458 NC組相比，miR-4458 mimics組HT-29細胞增殖活性顯著降低(P<0.05)，見圖4。

a：P<0.05，與對照組相比；b：P<0.05，與miR-4458 NC組相比。

2.6 miR-4458 mimics轉染對HT-29細胞凋亡的影響

與對照組和miR-4458 NC組相比，miR-4458 mimics組HT-29細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖5。

A：各組細胞凋亡檢測圖片；B：各組細胞凋亡率變化與對照組相比；b：P<0.05，與miR-4458 NC組相比。

2.7 miR-4458 mimics轉染對HT-29細胞遷移能力的影響

相同遷移時間下，與對照組和miR-4458 NC組相比，miR-4458 mimics組HT-29細胞遷移率顯著降低(P<0.05)，見圖6、表3。

圖6 各組HT-29細胞遷移圖片(白光明場，×100)

表3 miR-4458 mimics轉染HT-29細胞的遷移率

2.8 miR-4458 mimics轉染對HT-29細胞侵襲能力的影響

與對照組(308.96±21.07)個和miR-4458 NC組(296.82±27.35)個相比，miR-4458 mimics組HT-29細胞侵襲數量(95.86±22.52)個顯著降低(P<0.05)，見圖7。

圖7 miR-4458 mimics轉染對HT-29細胞侵襲能力的影響(結晶紫，×100)

2.9 miR-4458 mimics轉染對HT-29細胞EMT相關蛋白表達的影響

與對照組和miR-4458 NC組相比，miR-4458 mimics組HT-29細胞中E-cadherin蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，N-cadherin及Vimentin蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，見圖8、表4。

A：對照組；B：miR-4458 NC組；C：miR-4458 mimics組。

表4 各組細胞E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白表達情況

3 討 論

目前，用于診斷和檢測從腺瘤到CRC進展的常規方法為結腸鏡檢查和糞便潛血測試(FOBT)，但結腸鏡檢查價格昂貴且具有侵入性，FOBT靈敏度低，而miRNA可能是一種新的檢測方式[8]。此外，miRNA是介導腸內動態平衡的關鍵分子調節劑，與CRC進展密切相關[9]。本研究發現，miR-4458在結腸癌細胞和腫瘤組織中均低表達，轉染miR-4458 mimics后，HT-29細胞miR-4458表達水平顯著增高，提示轉染成功，同時過表達miR-4458能夠顯著抑制HT-29移植瘤體生長，miR-4458可能與結直腸癌的發生、發展密切相關。

STAT3是惡性腫瘤中公認的促癌蛋白，在癌癥侵襲性方面起重要調節作用，并影響腫瘤細胞的EMT過程[10-12]。本研究結果顯示，STAT3在結腸癌細胞和腫瘤組織中均高表達，轉染miR-4458 mimics后，結腸癌HT-29細胞中STAT3 mRNA表達顯著降低，提示miR-4458與STAT3可能存在靶向關系。經Targetscan Human數據庫預測，miR-4458與STAT3 mRNA 3′UTR區存在結合位點，且雙熒光素酶基因檢測報告顯示，與STAT3-3′UTR-WT+miR-4458 NC組比較，STAT3-3′UTR-WT+miR-4458 mimics組熒光素酶活性降低，表明miR-4458與STAT3存在靶向關系。在三陰性乳腺癌和乳腺癌細胞中，激活STAT3有助于促進癌細胞的遷移、侵襲和EMT進程[10-11]。另有研究顯示，STAT3是轉化生長因子-β1誘導的肝癌細胞EMT和肝癌轉移的正調節劑，因此推測miR-4458可能通過靶向抑制STAT3表達，抑制HT-29細胞的惡性生物學行為，但需進一步驗證[12]。

WU等[13]研究發現，miR-4458在乳腺癌腫瘤組織和細胞中低表達，模擬miR-4458能夠顯著抑制細胞遷移和侵襲；此外，過表達miR-4458能夠抑制肝癌細胞的侵襲、遷移和EMT，且肝癌組織中較低的miR-4458水平與不良預后相關[14-15]。本研究發現，與對照組和miR-4458 NC組相比，上調miR-4458水平可顯著降低HT-29細胞增殖、遷移和侵襲行為，誘導細胞凋亡，提示miR-4458可能是治療CRC腫瘤的目標miRNA，也可能與CRC預后相關。結腸癌具有很高的腫瘤侵襲性，這被認為是其最致命屬性[16]。其中，EMT參與調控腫瘤細胞和微環境間的相互作用，在腫瘤轉移中至關重要[17-18]。細胞黏附分子E-cadherin表達下降和間充質標記物Vimentin、N-cadherin表達增加是細胞運動能力提高，EMT發生的標志[19]。本實驗結果顯示，miR-4458 mimics組HT-29細胞E-cadherin蛋白表達顯著增加，而N-cadherin和Vimentin蛋白表達明顯減少，提示上調miR-4458，可明顯降低HT-29細胞運動相關的蛋白質表達，阻抑EMT進程。另有研究證實，防止STAT3活化與抑制大腸癌細胞EMT和腫瘤轉移相關[20]，因此推測miR-4458可能通過靶向抑制STAT3表達，抑制HT-29細胞的遷移、侵襲和EMT行為，miR-4458可能是治療CRC腫瘤的新靶點。

綜上所述，miR-4458可能通過靶向抑制STAT3表達，抑制HT-29細胞增殖、凋亡和EMT，為臨床治療CRC提供了新的靶標。但鑒于CRC發病機制復雜，可能涉及多種通路，本課題將聯合小鼠模型和臨床試驗對miR-4458的調控機制進行更深入研究。