芒果苷通過PI3K/Akt/mTOR通路對蛛網膜下腔出血后神經細胞的保護作用*

姬康祁,周文科

(新鄉醫學院第一附屬醫院神經外科/河南省神經修復重點實驗室，河南新鄉 453000)

蛛網膜下腔出血(SAH)是腦卒中的嚴重亞型[1]。研究人員認為SAH后72 h內發生的早期腦損傷(EBI)是SAH預后不良的主要原因[2]。已有研究表明，SAH后會導致嚴重的線粒體功能障礙[3]，進一步誘發細胞的氧化應激損傷和凋亡，從而導致神經細胞的損傷甚至死亡[4]，所以SAH的早期治療成為關注的重點。

芒果苷(MF)是天然存在于許多植物中的植物多酚，具有多種藥理作用，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤和治療糖尿病等[5-6]。有研究表明，MF可通過多種途徑去預防或者修復包括腦缺血再灌注損傷、腦炎等疾病；并且MF會通過影響線粒體凋亡相關蛋白的表達改善魚藤酮誘導的細胞凋亡[7]。有研究表明，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路可通過介導凋亡蛋白去抑制細胞凋亡[8]，而MF又具有廣泛的生物活性。本實驗旨在研究MF通過PI3K/Akt/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑改善蛛網膜下腔出血后早期階段神經細胞線粒體功能，從而抑制神經細胞的凋亡。

1 材料與方法

1.1 細胞

Neuro-2a細胞由中國科學院上海細胞庫購買。

1.2 主要試劑與儀器

青鏈霉素、FBS、DMEM/HIGH GLUCOSE培養基購于美國Hyclone公司，DMSO、高速低溫離心機、多功能酶標儀均購于美國Thermo Fisher Scientific公司，氧合血紅蛋白(OxyHb)購于上海源葉生物科技有限公司，MF購于美國MCE公司，MTT、JC-1熒光探針、DCFC-DA熒光探針、線粒體綠色熒光探針、溶酶體紅色熒光探針、細胞線粒體分離試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒均購于上海碧云天科技有限公司，凋亡相關蛋白淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2關聯X蛋白(Bax)、細胞色素C(Cyt-C)、Caspase-3抗體購于北京博奧森科技有限公司，PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR 抗體購自美國CST公司，37 ℃恒溫培養箱購于德國Heraeus公司，熒光顯微鏡購于德國Carl Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1Neuro-2a細胞培養及分組

Neuro-2a細胞的培養基為含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養基，置于37 ℃，5%的CO2培養箱中培養。根據文獻[9]提出的培養方法制備SAH細胞模型，對照組：常規進行換液，不加任何藥物處理；SAH組：在細胞培養24 h后，加入OxyHb，使其終濃度為10 μmol/L；MF+SAH組：加入250 μmol/L的MF，孵育30 min，加入OxyHb，使終濃度達到10 μmol/L。

1.3.2MTT檢測Neuro-2a細胞的活力

取對數生長期的Neuro-2a細胞按照每孔1×104/100 μL接種到96孔板中，每組設6個復孔，于37 ℃，5%的CO2培養箱中培養，24 h后，加入不同濃度的MF預處理30 min，加入OxyHb，培養箱中繼續培養24 h后每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，置于培養箱繼續培養4 h后加入100 μL的二甲基亞砜，在室溫中充分搖勻，用多功能酶標儀檢測490 nm處的吸光度。

1.3.3熒光顯微鏡觀察Neuro-2a細胞線粒體膜電位(Δψm)和ROS

在細胞完成貼壁后，加入OxyHb和MF處理繼續培養24 h，加入JC-1熒光探針染色30 min，該探針可聚集在線粒體的基質中，形成聚合物，當Δψm較高時，激發光會激發紅色熒光，當出現線粒體功能障礙時，Δψm較低，線粒體會產生綠色熒光，可以用紅綠熒光的相對比例去衡量Δψm的變化。細胞培養結束后，分別向各組加入DCFC-DA熒光探針(10 μmol/L)后孵育30 min后用孵育液洗滌，用熒光顯微鏡(Zeiss Axio A1)對上述實驗細胞拍照記錄。

1.3.4多功能酶標線測定Neuro-2a細胞Δψm和RQS

Neuro-2a細胞按照3×105/孔接種到6孔板中。細胞造模并加藥后繼續培養24 h后收集細胞，用PBS洗2次，加入500 μL JC-1工作液，37 ℃孵育30 min，利用多功能酶標儀測定，如果JC-1為單體進入線粒體內部，則以激發光485 nm，發射光535 nm檢測出綠光，如果JC-1為聚合體位于線粒體外膜，則以激發光530 nm，發射光600 nm檢測JC-1為紅光。采用綠紅比(單體:聚合體)熒光強度法測定Δψm，綠紅比率低代表Δψm處于極化狀態；反之，Δψm處于去極化狀態。

1.3.5測定Neuro-2a細胞ROS量

按1.3.4方法對細胞造模并加藥后繼續培養24 h，用PBS反復洗滌，加入DCFC-DA 探針(10 μmol/L)在37 ℃保溫箱中避光孵育30 min。應用多功能酶標儀，以激發光485 nm，發射光535 nm檢測熒光強度。

1.3.6熒光顯微鏡觀察Neuro-2a細胞線粒體和溶酶體的共同定位

Neuro-2a細胞按1.3.1方法在6孔板中培養24 h，用OxyHb和MF處理繼續孵育24 h，在實驗結束以后向3組培養基中分別加入線粒體熒光綠色探針和溶酶體紅色探針，37 ℃孵育30 min后，吸去培養基，PBS洗滌多次，置于熒光顯微鏡下拍照。

1.3.7Western blot 檢測MF對Neuro-2a細胞中PI3K、Akt、mTOR、Bcl-2、Bax、CytC、Caspase-3的表達

Neuro-2a細胞通過線粒體分離試劑提取出線粒體蛋白和胞漿蛋白，BCA法測定蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濃縮膠80 V、20 min，分離膠100 V，1 h，轉膜(100 mA、150 min)，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗包括：Caspase-3 1∶1000；Bcl-2 1∶500；Bax 1∶500；Cytc 1∶500；PI3K 1∶200；p-PI3K 1∶200；Akt 1∶200；p-Akt 1∶200；mTOR 1∶200；p-mTOR 1∶200；GAPDH 1∶2 000；COXⅣ 1∶2 000；兔抗β-actin抗體1∶2 000，于4 ℃搖床孵育過夜，室溫孵育二抗山羊抗兔IgG 抗體(1∶1 000)1 h，顯影曝光。用Image-J圖像分析系統對蛋白條帶進行分析。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 MF對Neuro-2a細胞的活力影響

MTT實驗的檢測法顯示。隨著MF濃度增加，Neuro-2a細胞活力均下降，并且與MF濃度增加呈正相關，50、100、150、200、250 μmol/L組24 h抑制率分別為(1.254±0.125)%、(4.369±0.256)%、(10.752±0.345)%、(20.235±0.798)%、(27.952±0.898)%，差異均有統計學意義(P<0.05)，而250 μmol/L組最為顯著，故采用250 μmol/L濃度進行實驗。

2.2 MF對Neuro-2a細胞Δψm的影響

與對照組中較多的紅色信號相比，OxyHb誘導了較多的綠色熒光信號，在線粒體外成員處積累了較多的單體。然而，MF逆轉了這一現象，檢測到更多的紅色熒光信號。對照組Δψm為7.91±0.21，SAH組明顯較對照組升高9.38±0.39(P<0.05)，而應用MF之后Δψm恢復為8.31±0.25(P<0.05)，見圖1。

A:對照組；B:SAH組；C：SAH+MF組。

2.3 MF對Neuro-2a細胞內ROS的影響

MF治療后則綠色熒光明顯降低。定量分析顯示SAH組ROS水平由對照組的1.82 ± 0.02顯著升高至2.61 ± 0.05(P<0.01)，而MF治療后則以劑量依賴方式減少ROS的生成，ROS水平降低為2.31± 0.03(P<0.01)，見圖2。

A:對照組；B:SAH組；C：SAH+MF組。

2.4 MF對Neuro-2a細胞的線粒體和溶酶體共同定位的影響

與對照組相比，SAH組存在大量綠色熒光，大量線粒體因功能障礙集聚在細胞中無法被清除，在應用MF后溶酶體又重新吞噬受損線粒體，見圖3。

A:對照組；B:SAH組；C：SAH+MF組。

2.5 通過Western blot檢測MF對Neuro-2a細胞內PI3K、Akt、mTOR表達的影響

與對照組相比，SAH組中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 的表達水平明顯下調(P<0.05)；與SAH組相比，MF+SAH組中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 的表達水平顯著上調(P<0.05)，見圖4、表1。

A：對照組；B：SAH組；C：SAH+MF組。

表1 3組Neuro-2a細胞胞漿內PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的表達比較

2.6 通過Western blot檢測MF對Neuro-2a細胞胞漿內和線粒體內Cyt-C釋放的影響

與對照組相比，SAH組線粒體中Cyt-C明顯下降(P<0.05)；與SAH組對比，MF+SAH組細胞線粒體中Cyt-C明顯上升(P<0.05)。與對照組相比，SAH組細胞胞漿中Cyt-C明顯上升(P<0.05)；與SAH組對比，MF+SAH組細胞胞漿中Cyt-C明顯下降(P<0.05)，見圖5、表2。

A：對照組，B：SAH組，C：SAH+MF組。

表2 3組Neuro-2a細胞胞漿和線粒體內Cyt-C的表達比較

2.7 通過Western blot檢測MF對Neuro-2a細胞中凋亡蛋白的表達

與對照組對比，SAH組中蛋白Bax和Caspase-3表達均明顯上升(P<0.05)；蛋白Bcl-2的表達明顯下降(P<0.05)。與SAH組對比，MF+SAH干預組中蛋白Bax和Caspase-3表達均明顯下降(P<0.05)；蛋白Bcl-2的表達明顯上升(P<0.05)，圖6、表3。

A：對照組；B：SAH組；C：SAH+MF組。

表3 3組Neuro-2a細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3的表達比較

3 討 論

線粒體被認為是許多信號分子相互溝通、控制氧化應激、細胞鈣緩沖、凋亡、自噬的信號平臺[10-11]。SAH早期階段由于腦組織的急性腦損傷造成神經細胞內線粒體功能障礙，進一步導致神經細胞的凋亡[12]；而SAH后的OxyHb刺激是誘導線粒體損傷的重要原因，損傷的線粒體釋放大量ROS和細胞色素C到達胞質，最終造成神經細胞的凋亡[13-14]。本實驗中SAH細胞模型關于凋亡的實驗結果也印證了這一點。所以推測線粒體在SAH早期階段發揮著至關重要的作用，在本研究中以維持線粒體功能穩定為目標減緩神經細胞的凋亡。本研究結果證實，MF可以通過改善線粒體功能障礙從而抑制神經細胞的凋亡，達到神經保護作用。

MF是一種主要從龍膽科和漆樹科植物中提取的氧雜蒽酮類化合物，也是中藥知母的主要活性成分[15]，具有強大的抗氧化和清除氧自由基等特點，因此在治療早期SAH中是一個非常有前景的藥物，但SAH發病機制復雜，MF在SAH中如何改善線粒體功能障礙，從而達到對神經細胞的保護作用成為關注的重點。

本課題組早期實驗已證實SAH后氧合血紅蛋白誘導[Ca2+]m超載[16]，導致Δψm去極化，使線粒體釋放過量的ROS造成神經細胞的氧化應激，從而造成線粒體功能障礙，使Cyt-C從線粒體內逐漸轉移到胞漿里，從而誘導Caspase-3的活化，Caspase-3活化后進一步調控下游凋亡蛋白，從而引發凋亡級聯反應，而線粒體內的Cyt-C則減少，反過來又誘發ROS的釋放，進一步加劇線粒體的損傷。本研究發現，MF治療后，Δψm恢復正常，且細胞內ROS水平下降到正常水平，緩解了SAH后神經細胞的氧化應激，表明MF具有抗氧化和清除氧自由基的特點。結果表明，SAH組細胞胞漿內Cyt-C表達顯著增加，線粒體內Cyt-C表達顯著減少，Bax和Caspase-3表達顯著增加，Bcl-2表達顯著減少；應用MF后，胞漿內Cyt-C表達顯著下降，線粒體內Cyt-C表達顯著增加，Bax和Caspase-3表達顯著減少，Bcl-2表達顯著增加。以上結果表明MF可通過維持Δψm穩定，降低ROS產生的氧化應激，從而抑制細胞內凋亡的級聯反應。

而MF如何在SAH后的神經細胞中發揮作用，去改善線粒體功能障礙和抑制神經細胞的凋亡成為關注的重點。PI3K/Akt/mTOR信號通路在細胞生長、細胞周期、凋亡、自噬等方面有重要調節作用[17]。有研究報道PI3K/Akt通路對于細胞的凋亡有抑制作用，而磷酸化的Akt可進一步激活mTOR信號通路，mTOR信號通路作為該通路的重要下游效應蛋白，對細胞凋亡起著重要作用[18]。本研究結果顯示，SAH組神經細胞內p-PI3K、p-Akt、p-mTOR的表達均降低，而細胞內Bax、Caspase-3和Cyt-C的表達升高，Bcl-2的表達下降，表明PI3K/Akt/mTOR通路在SAH早期階段可能受到了抑制，從而下游凋亡蛋白表達升高。而MF+SAH組，p-PI3K、p-Akt、p-mTOR的表達均增強，而相關凋亡蛋白表達受到抑制。說明MF通過PI3K/Akt/mTOR通路參與了對神經細胞內凋亡蛋白的調控。正常情況下，線粒體受損后溶酶體會被誘導清除受損線粒體，去維持線粒體的更新和功能。根據線粒體熒光和溶酶體熒光表明，在SAH組中更多的受損線粒體因為功能障礙而導致無法被溶酶體清除。而通過MF治療過后，更多的線粒體被清除，預示著線粒體進入正常的清除途徑，也可以從側面反映出神經細胞線粒體功能障礙恢復正常。

綜上所述，研究表明MF可以通過穩定Δψm，減少ROS的產生，改善線粒體功能障礙，從而抑制SAH早期階段神經細胞的凋亡，而對于凋亡蛋白的調控與PI3K/Akt/mTOR通路有著密不可分的關系，MF有望成為治療早期SAH中潛在的治療靶點。