苗藥鐵筷子對免疫抑制小鼠免疫功能的影響*

丁曉麗，索 萍，錢海兵

(1.貴州中醫藥大學，貴陽 550025；2.貴州省中醫藥方證藥理研究特色重點實驗室，貴陽 550025)

免疫通常是指非己抗原性物質進入體內，機體能清除異物，保持身體功能平衡的一種生理功能。當免疫過強時會引發超敏反應、類風濕性關節炎等自身免疫性疾病，但當免疫功能過低時又會誘發其他免疫缺陷綜合征[1]，因此尋找有效穩定的免疫調節劑十分重要。苗藥鐵筷子(Helleborus thibetnus Franch.)為蠟梅科蠟梅屬(Chimonanthus)植物蠟梅(Chimonanthus Praecox L.Link)及山蠟梅(Chimonanthus nitens Oliv.)的干燥根及根莖[2]。課題組前期有將其用于類風濕性關節炎的研究，但并未進行針對免疫影響的探索。因此本文采用環磷酰胺建立免疫力低下小鼠模型，探究鐵筷子對免疫功能低下狀態的影響，為苗藥鐵筷子用于免疫性疾病提供藥理學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，實驗動物使用許可證：SCXK(遼)2015-0001。

1.1.2主要儀器

紫外可見分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司)；低溫高速離心機(XK-400，江蘇新康醫療器械有限公司)；電子分析天平(ALC-210.3，北京愛科勒有限公司)；酶標儀(Infinite M200，北京新風機電技術公司)；8 mm小鼠耳朵打孔器；血細胞分析儀(XT-2000i，希森美康集團)。

1.1.3藥品與試劑

黃芪顆粒(貴州漢方藥業有限公司，批號20180312)；環磷酰胺(源業生物有限公司，批號X22D8Y51136)；印度墨汁(源業生物有限公司，批號L08A9G67537)；干擾素(IFN)-γ酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(欣博盛生物有限公司，批號M181128-101a)；白細胞介素(IL)-6 ELISA試劑盒(欣博盛生物有限公司，批號M181128-004a)；IL-2 ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司，批號ml083138)；腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒(欣博盛生物有限公司，批號M181128-102a)；IgM ELISA試劑盒(欣博盛生物有限公司，批號M181128-129a)；補體C3 ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號DP7VCQ53L1)；補體C4 ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司，批號ml002048)。

1.1.4苗藥鐵筷子水煎液制備

苗藥鐵筷子，采自貴陽市烏當區三江鎮農場，經貴州中醫藥大學藥學院生藥教研室劉曉龍博士鑒定為蠟梅科蠟梅屬植物蠟梅的根。鐵筷子水煎液的制備：取鐵筷子藥材100 g，加水，浸泡0.5 h，然后用電磁爐加熱、過濾，連續2次，合并2次濾液，濃縮至100 mL，最后得到鐵筷子水煎液，其濃度為1 g/mL，使用前用水稀釋成相應倍數。

1.2 方法

1.2.1動物分組及處理

SPF級昆明種小鼠，180只，雌雄各半，適應性喂養7 d后分成空白組，模型組，鐵筷子水煎液高、中、低劑量組(1.00、0.50、0.25 g/mL)，陽性組(黃芪顆粒0.50 g/mL)。于實驗第1天，除空白組外，其余各組小鼠均用環磷酰胺(50 mg/kg)隔日腹腔注射給藥，連續30 d，共注射15次，建立免疫低下小鼠模型。空白組腹腔注射等體積生理鹽水。給藥組分別按鐵筷子水煎液高、中、低劑量灌胃給藥，陽性組給以黃芪顆粒水溶液，空白組和模型組灌胃等體積生理鹽水，每天灌胃1次，連續30 d。每天灌胃時間晚于環磷酰胺注射時間30 min。

1.2.2小鼠體重增長率、免疫器官指數的測定

末次給藥24 h后，各組小鼠抽取10只，記錄小鼠體重，摘眼球取血，頸椎脫臼處死，取胸腺，用濾紙吸干臟器并稱重，計算臟器指數。計算公式:體重增長率%=(最終體重-初始體重)/初始體重×100%。胸腺指數=胸腺重量(mg)/體重(g)。

1.2.3遲發型超敏反應的測定

于給藥后第20天，各組中選取10只小鼠腹部去毛，范圍為3 cm2。均勻涂抹配制好的1%的二硝基氟苯，連續致敏5 d，實驗最后1 d前將1%的二硝基氟苯10 μL均勻涂抹在小鼠右耳兩面進行攻擊，左耳涂抹丙酮。24 h后，摘眼球取血0.6～1.0 mL于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，處死小鼠后，用8 mm的小鼠耳打孔器，打下耳片，于萬分之一的天平上精密稱量其重量。左右耳重量之差即為腫脹度。腫脹度=右耳重量-左耳重量。

1.2.4碳廓清實驗

1.2.5小鼠血清中IFN-γ，IL-2，IL-6，TNF-α，IgM，補體C3、C4水平及全血中紅細胞與白細胞數的測定

將1.2.2所取的小鼠血進行離心，3 000 r/min離心10 min分離血清，裝入EP管，-80℃保存備用，參照ELISA試劑盒說明書，檢測血清中IFN-γ，IL-2，IL-6，TNF-α，IgM，補體C3、C4的水平。將1.2.3取得的小鼠全血在4 h內,利用血細胞分析儀對小鼠全血中的紅細胞和白細胞的數量進行檢測。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 對免疫抑制小鼠體重增長率和免疫器官指數的影響

模型組小鼠體重增長率、胸腺指數顯著下降(P<0.05)，免疫抑制小鼠造模成功。鐵筷子水煎液低、中劑量組及陽性組可提高免疫抑制小鼠的體重增長率，與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；鐵筷子各給藥組和陽性組提高了免疫抑制小鼠胸腺指數(P<0.05)，見圖1。

1:空白組；2:模型組;3:低劑量組;4:中劑量組;5:高劑量組;6:陽性組；a：P<0.05，與空白組比較；b：P<0.05，與模型組比較。

2.2 對免疫抑制小鼠遲發型超敏反應的影響

模型組小鼠耳腫脹與空白組相比明顯降低(P<0.05)，與模型組相比，鐵筷子中劑量、陽性組可顯著增加小鼠耳腫脹度，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

1:空白組；2:模型組;3:低劑量組;4:中劑量組;5:高劑量組;6:陽性組；a：P<0.05，與空白組比較；b：P<0.05，與模型組比較。

2.3 對免疫抑制小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響

與空白組比較，模型組和各給藥組小鼠吞噬指數降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，除陽性組外，各給藥組小鼠吞噬指數雖有增長但不顯著(P>0.05)，見圖3。

1:空白組；2:模型組;3:低劑量組;4:中劑量組;5:高劑量組;6:陽性組；a：P<0.05，與空白組比較；b：P<0.05，與模型組比較。

2.4 對免疫抑制小鼠血清中IFN-γ，IL-2，IL-6，TNF-α，IgM，補體C3、C4及全血中紅細胞(RBC)，白細胞(WBC)的影響

模型組小鼠體內IFN-γ，IL-2，IL-6，TNF-α，IgM，補體C3、C4水平及RBC和WBC計數均降低，與空白組比較具差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，鐵筷子中、高劑量及陽性組IFN-γ水平升高，鐵筷子高劑量及陽性組IL-6、IL-2、補體C4水平升高，鐵筷子組及陽性組TNF-α水平升高，鐵筷子中、高劑量及陽性組小鼠體內IgM、補體C3水平均升高，且鐵筷子各劑量給藥組都提高免疫抑制小鼠的RBC與WBC計數，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

1:空白組；2:模型組;3:低劑量組;4:中劑量組;5:高劑量組;6:陽性組；a：P<0.05，與空白組比較；b：P<0.05，與模型組比較。

3 討 論

免疫器官、免疫細胞和免疫分子共同構成了人體免疫系統，免疫功能紊亂時常引起疾病的發生，其中免疫力低下對機體防御能力有很大的影響，因此增強免疫能力是預防疾病發生的關鍵[3]。胸腺是一重要的中樞免疫器官，T淋巴細胞的生長發育與胸腺密切相關，T淋巴細胞可直接殺傷靶細胞，釋放淋巴因子加強免疫應答[4-5]，胸腺指數反映了機體免疫能力的強弱。本次造模藥物選用環磷酰胺構建免疫抑制小鼠模型，環磷酰胺可引起免疫器官重量減輕，產生免疫抑制[6-7]。因此，本次實驗采用小劑量多次注射環磷酰胺(50 mg/kg)的方法建立免疫力低下小鼠模型[8]，結果表明注射過環磷酰胺的小鼠體重增長率明顯下降，胸腺指數顯著降低，說明免疫抑制小鼠模型造模成功，灌胃給藥后，鐵筷子可提高免疫抑制小鼠的體重增長率、胸腺指數來改善免疫抑制小鼠的免疫能力，說明鐵筷子具有機體免疫保護作用。

吞噬指數主要用于判斷巨噬細胞吞噬能力的強弱[9]，碳廓清實驗常用于巨噬細胞吞噬能力的檢測。本研究表明苗藥鐵筷子對免疫抑制小鼠巨噬細胞吞噬能力有改善作用。遲發型超敏反應是Ⅳ型細胞介導的遲發型變態反應，當機體再次受到相同抗原刺激后，抗原提呈細胞會作用于效應T細胞，CD4+細胞可通過分泌趨化因子，產生免疫損傷作用，出現炎癥反應、腫脹[10]。模型組小鼠其免疫受到抑制，耳腫脹不明顯，但鐵筷子可增強免疫抑制小鼠免疫能力，提高免疫應答。紅細胞、白細胞水平同樣也反映了機體免疫能力的強弱，紅細胞可識別攜帶抗原、促進巨噬細胞的吞噬能力，白細胞參與了機體的防御反應[11]，鐵筷子可提高免疫抑制小鼠RBC、WBC數量，表明苗藥鐵筷子可通過調節RBC、WBC的數量調節免疫能力。

血清中的細胞因子、免疫球蛋白以及補體含量的變化反映了機體免疫能力的強弱，Th細胞可辨識抗原提呈細胞，維持機體正常免疫功能，主要分為Th1和Th2兩個亞型，Th1型包括IL-2、TNF-α、IFN-γ；Th2型包括IL-6、IL-9等[12]。IFN-γ具有抗病毒、抑制細胞增殖、調節免疫及抗腫瘤作用；TNF-α主要由活化的巨噬細胞、NK細胞及T淋巴細胞產生；IL-6由活化巨噬細胞產生，可促進淋巴細胞增殖[13]；IL-2由活化T淋巴細胞產生，在調節免疫應答中具有重要作用[14]。免疫球蛋白是B淋巴細胞在抗原刺激下轉化為漿細胞，可以產生能與抗原發生特異性結合的抗體[15]。其中IgM是分子量最大的免疫球蛋白，具有強大的殺菌、激活補體、免疫調理和凝集作用；補體C3主要由巨噬細胞和肝臟合成，在補體經典激活途徑和旁路激活途徑中發揮著重要的作用。注射了環磷酰胺的小鼠IFN-γ，IL-2，IL-6，TNF-α，IgM，補體C3、C4水平顯著降低，鐵筷子可明顯提高這些因子的含量，特別是高、中劑量組，提示鐵筷子可通過調節細胞因子，IgM，補體C3、C4來調節機體免疫能力。

免疫系統是一個復雜的綜合體，其調節可能受多種因素的影響，前期課題組在對類風濕性關節炎的研究中，鐵筷子的免疫抑制作用并不是其治療的主要途徑。本次實驗發現鐵筷子具有增強免疫的能力，可通過提高胸腺指數、巨噬細胞吞噬能力以及調節體內細胞因子，IgM，補體C3、C4的水平，RBC、WBC數量來增強機體免疫能力，改善免疫抑制狀態。