miR-21通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路對缺氧誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞活性的作用機(jī)制*

袁 媛，韓大鵬，朱永新

(1.上海城建職業(yè)學(xué)院健康與社會(huì)關(guān)懷學(xué)院 201415；2.上海光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院關(guān)節(jié)外科 200000；3.安徽省池州市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科 247000)

缺氧缺血性心臟病是血管動(dòng)脈狹窄或阻塞導(dǎo)致局部心肌組織血氧供應(yīng)不足而產(chǎn)生心臟功能障礙的臨床疾病[1]。研究表示，缺血缺氧性心臟病發(fā)病率、病死率逐年升高，機(jī)體動(dòng)脈血流中斷，局部損傷的心肌組織細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，可促進(jìn)心肌梗死[2]。目前，臨床采用支架置入進(jìn)行擴(kuò)張血管，增加血氧供應(yīng)，但是也增加心肌缺血再灌注概率，損傷心肌細(xì)胞。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路是機(jī)體重要信號(hào)通路，磷酸化過程中產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞生物活性[3]。以往文獻(xiàn)研究表示，PI3K/Akt能夠抑制線粒體凋亡，降低Bax活性，從而減少細(xì)胞凋亡，改善病情[4]。

近些年隨著生物分子靶向技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)了解miRNAs與缺氧缺血性心臟病存在關(guān)聯(lián)性，可以根據(jù)miRNAs在疾病中表達(dá)水平的差異，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與心肌細(xì)胞凋亡及新生血管關(guān)系密切。文獻(xiàn)證實(shí)，在缺血心肌梗死大鼠心肌組織中檢測出多種miRNA水平異常，其中miR-214、miR-233表達(dá)升高，而miR-21水平降低，說明低表達(dá)miR-21對缺血缺氧心肌保護(hù)作用降低[5]。miR-21起初被認(rèn)為具有加快癌細(xì)胞增殖擴(kuò)散的作用，目前已經(jīng)證實(shí)在心臟、肝脾及腸道組織中均有表達(dá)。研究證實(shí)，miR-21是心臟特異性小分子RNA，在成人心臟中表達(dá)較高，具有維持心臟生物功能的作用[6]。以往關(guān)于PI3K/Akt信號(hào)通路在缺血缺氧心肌細(xì)胞中的研究結(jié)果無一致性，并與miR-21之間的關(guān)系尚少見研究。因此，本文進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，觀察miR-21調(diào)節(jié)PI3K/Akt對缺氧小鼠心肌細(xì)胞活性的作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級SD鼠齡1～3 d的雌雄混合的小鼠購自上海弘順生物，體重200～300 g，許可證號(hào)：SCXK(滬)2020-0002，在常溫下濕度為55%，模擬黑白交替無菌飲食2周，實(shí)驗(yàn)要求符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》規(guī)定管理規(guī)定，本次實(shí)驗(yàn)經(jīng)復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑及儀器

miR-21擬似物(mimcs)和陰性對照(negative control,NC)、miR-21抑制物(inhibitor)均購自百奧生物技術(shù)(南通)有限公司；PI3K、P-PI3K；Akt、p-Akt均購自美國 Cell Signaling Technology公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；MTT、二甲基亞砜(DMSO)購自上海研謹(jǐn)生物科技公司；電泳儀購自北京由萊普特科學(xué)儀器公司;流式細(xì)胞儀購自北京德利卡生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1小鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)

15只鼠齡1～3日小鼠，75%乙醇消毒后放入超凈臺(tái)，逐層分離皮膚后分離心臟，放入胎牛血清培養(yǎng)基，最大程度上排除心臟積血，剪去多余的血管組織，更換培養(yǎng)基后采用PBS清洗3次，將心臟剪成1 mm3體積大小放入EP管中，加入1.5 mL消化酶，放入培養(yǎng)箱中消化組織，振蕩5 min，提取上清液保留于EP管，上述過程重復(fù)8次后，采用200目過濾網(wǎng)分離細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，取對數(shù)心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞缺氧模型構(gòu)建

將正常心肌細(xì)胞培養(yǎng)基植入低氧環(huán)境中，后通入5%N2+5%CO2混合氣體4 h，流速為2 L/min，與低糖培養(yǎng)基重復(fù)混合后，加入飽和無血清培養(yǎng)基，后將細(xì)胞放入37 ℃無氧環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)4 h備用。

1.2.3分組及轉(zhuǎn)染方法

正常心肌細(xì)胞為A組，在37 ℃、5%二氧化碳環(huán)境中正常培養(yǎng)；缺氧心肌細(xì)胞分別分為B組(缺氧心肌細(xì)胞)、C組(缺氧心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21 mimics)及D組(缺氧心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor)。應(yīng)用羧基熒光素(FAM)熒光標(biāo)記miR-21 mimics、miR-21 inhibitor觀察轉(zhuǎn)染效果，確定mimics的最佳轉(zhuǎn)染濃度為20 nmol/L，inhibitor的最佳轉(zhuǎn)染濃度為 100 nmol/L。轉(zhuǎn)染方法：將數(shù)量為1×104個(gè)心肌細(xì)胞，在EP管中放入200 μL轉(zhuǎn)染液體和4 μL脂質(zhì)體，后加入5 μg的miR-21 mimics/inhibitor，充分混合后，轉(zhuǎn)染6 h后備用。

1.2.4RT-PCR 檢測miR-21、PI3K、Akt mRNA的表達(dá)

將上述組別中的心肌細(xì)胞放入EP試管中，提取其RNA，75%乙醇離心，-80 ℃保存。將RNA轉(zhuǎn)化DNA，內(nèi)參采用GAPDH，PCR循環(huán)以95 ℃變性，60 ℃退火后，延伸5 min，循環(huán)40次，用2-ΔΔCt的方法計(jì)算相對表達(dá)水平，參考相關(guān)文獻(xiàn)合成引物[7]，序列見表1。

表1 RT-PCR中各指標(biāo)引物序列

1.2.5MTT法檢測心肌細(xì)胞活力

各組細(xì)胞取少量胰蛋白酶消化后，每組設(shè)置6孔，均加入150 μL細(xì)胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)在加入MTT(5 g/L)，每孔20 μL，遮光條件下加入200 μL的二甲基亞砜溶液，輕微搖晃15 min后促使充分溶解后，在波長490 nm檢測吸光度(A值)，取3次平均值。心肌細(xì)胞活力參考文獻(xiàn)[7]。

1.2.6Hoechst熒光染色檢測

各組心肌細(xì)胞，放入5 μg/L的染液，多聚甲醛固定30 min。采用TrintonX-100透明處理，加入Hoechst熒光材料染色，置常溫下0.5 h，風(fēng)干后每張切片選擇不重復(fù)的5個(gè)方位進(jìn)行觀察。細(xì)胞凋亡：INS-1細(xì)胞核固縮，呈現(xiàn)碎片狀，凋亡率=凋亡細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.7流式細(xì)胞儀檢測

各組心肌細(xì)胞加入少量胰蛋白酶，消化4 h后，用冷藏在-20 ℃的乙醇固定，24 h后進(jìn)行離心，采用PBS沖洗3次，每次3～5 min，后進(jìn)行避光染色，后采用流式細(xì)胞儀分析心肌細(xì)胞凋亡率。

1.2.8Western blot檢測

常規(guī)方法取各組心肌細(xì)胞50 μg，洗凈烘干電泳槽，制備12%分離膠，制作1 cm的水層。將電泳裝置放置聚膠1 h，配制灌注成層膠。每孔分別加入樣品懸液50 μg。90 V電泳，溴酚藍(lán)倒入分離膠，等待電壓升高至120 V電泳，最后終止電泳。電泳終止，取出凝膠，甲醇放入聚偏二氟乙烯(PVDF)膜放置5～10 s。在15 min內(nèi)轉(zhuǎn)膜液浸泡濾紙。10 min內(nèi)移進(jìn)轉(zhuǎn)膜槽內(nèi)，加進(jìn)轉(zhuǎn)膜液，轉(zhuǎn)膜槽進(jìn)行冰浴，70 V，1.5 h。轉(zhuǎn)膜完成時(shí)，從膜槽內(nèi)把PVDF膜取出，TBST洗2次，每次10 min。PVDF膜置于封閉液，水平搖床密封2 h。然后把PVDF膜裝進(jìn)有一抗PI3K、Akt、GAPDH抗體的自制雜交袋內(nèi)，4 ℃過夜。待膜取出，將PVDF膜用1×TBST洗3次，每次10 min，沖洗完成后，把膜放入對應(yīng)的二抗中常溫孵育1.5 h，輕輕晃動(dòng)。待孵育結(jié)束，TBST洗3次，每次10 min，將ECL顯色液A液和B液混合為工作液，按1∶1比例，加工作液到PVDF膜內(nèi)，1 min。PVDF膜檢測采用自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌細(xì)胞中miR-21表達(dá)比較

與A組相比，B組心肌細(xì)胞miR-21表達(dá)下調(diào)，組間比較差異明顯(t=11.863，P<0.001)，與B組相比，轉(zhuǎn)染miR-21 mimics后C組miR-21表達(dá)明顯升高(t=15.693，P<0.001)，轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor后D組miR-21表達(dá)明顯降低(t=10.062，P<0.001)，見圖1。

2.2 各組心肌細(xì)胞活力比較

心肌細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，B組與A組相比活力明顯降低(t=16.971，P<0.001)，與B組相比，C組心肌細(xì)胞活力升高(t=14.310，P<0.001)，與B組相比，D組心肌細(xì)胞活力下降(t=8.639，P<0.05)，見圖2。

a：P<0.05,與A組相比；b：P<0.05,與B組相比;c：P<0.05,與C組相比。

2.3 Hoechst心肌細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst熒光結(jié)果顯示，B組心肌細(xì)胞凋亡率較A組相比顯著上升(t=14.470，P<0.001)，與B組相比，轉(zhuǎn)染miR-21 mimics后C組心肌細(xì)胞凋亡率降低(t=10.690，P<0.001)，轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor后D組心肌細(xì)胞凋亡率升高(t=25.050，P<0.001)，見圖3。

A：Hoechst熒光檢測各組心肌細(xì)胞凋亡情況(200×)；B：各組心肌細(xì)胞凋亡率比較；a：P<0.001,與A組相比；b：P<0.001,與B組相比;c：P<0.001,與C組相比。

2.4 流式細(xì)胞儀心肌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：與A組相比，B組心肌細(xì)胞凋亡率升高(t=52.45，P<0.001)，C組較B組心肌細(xì)胞凋亡率有所降低(t=31.480，P<0.001)，D組心肌細(xì)胞凋亡率相對于B組明顯升高(t=32.10，P<0.001)，見圖4。

A:流式細(xì)胞儀檢測各組心肌細(xì)胞凋亡情況；B：各組心肌細(xì)胞凋亡率比較；a：P<0.05,與A組相比；b：P<0.05,與B組相比;c：P<0.05,與C組相比。

2.5 Western blot檢測心肌細(xì)胞中PI3K/Akt蛋白表達(dá)

Western blot條帶灰度值計(jì)算結(jié)果顯示：與A組相比，B組心肌細(xì)胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)均下降(tPI3K=39.190，tp-PI3K=9.492，tAkt=22.860,tp-Akt=11.900，均P<0.001)，與B組相比，C組上述蛋白表達(dá)有所升高(tPI3K=11.760，tp-PI3K=5.477，tAkt=10.660,tp-Akt=3.188，均P<0.001)，轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor后D組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)均低于B組(tPI3K=19.130，tp-PI3K=24.000，tAkt=23.940,tp-Akt=14.110，均P<0.001)。見圖5、6。

圖5 各組心肌細(xì)胞PI3K/Akt及其磷酸化表達(dá)

2.6 PCR檢測心肌細(xì)胞中PI3K、Akt mRNA表達(dá)

與A組相比，B組心肌細(xì)胞中PI3K、Akt mRNA表達(dá)下調(diào)(tPI3K=11.890，tAkt=9.798，均P<0.001)，C組上述表達(dá)與B組相比明顯升高(tPI3K=6.896，tAkt=7.323，均P<0.001)，D組受抑制劑影響PI3K、Akt mRNA表達(dá)與B組相比降低明顯(tPI3K=8.435，tAkt=10.310，均P<0.001)，見圖7。

a：P<0.05,與A組相比；b：P<0.05,與B組相比;c：P<0.05,與C組相比。

a：P<0.05,與A組相比；b：P<0.05,與B組相比;c：P<0.05,與C組相比。

3 討 論

心肌細(xì)胞活性受多種蛋白質(zhì)調(diào)控，主要通過兩種不同的機(jī)制發(fā)揮作用，分為內(nèi)外源性及外源性，內(nèi)源性包含應(yīng)激、缺氧及基因損傷等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，例如Bax凋亡信號(hào)被激活時(shí)，能夠加速cyto-c釋放并快速進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)促進(jìn)Caspase-9信號(hào)表達(dá)，進(jìn)而觸發(fā)凋亡信號(hào)，損傷心肌細(xì)胞[8]。外源性心肌細(xì)胞凋亡是通過增加Fas死亡受體而激活Caspase-3信號(hào)，從而加快凋亡機(jī)制。目前，對于抑制心肌細(xì)胞凋亡的研究一直是醫(yī)學(xué)界研究的重點(diǎn)。

miRNAs具有介導(dǎo)DNA產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄及抑制其表達(dá)的小編碼RNA，RNA與缺氧心臟疾病之間的關(guān)系[9]。miR-21具有高度保守性，在血液及多種器官組織中均有表達(dá)，隨著該信號(hào)通路的深入研究，其在缺氧心肌細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)，而體外實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染miR-21能夠通過減少凋亡因子PDCD4及下游因子AP-1而減少凋亡[10-11]。吳若霞等[12]通過外源性增加miR-21能夠通過降低PTEN表達(dá)而抑制心肌細(xì)凋亡。梁麗英等[13]研究表明,上調(diào)miR-21能夠通過降低PDCD4而減少心肌細(xì)胞損傷，本文與之研究結(jié)果相似。本研究通過給予心肌細(xì)胞體外增加miR-21模擬物，轉(zhuǎn)染成功后增加細(xì)胞存活率，降低凋亡，說明miR-21過表達(dá)對缺氧心臟疾病有保護(hù)作用。研究機(jī)制可能在于miR-21高表達(dá)能夠減少缺血心臟疾病發(fā)生，可抑制凋亡靶向基因進(jìn)而減少凋亡，這與SHEN等[14]研究結(jié)果相似。

PI3K/Akt在惡性腫瘤中屬于原癌基因，能夠隨著惡性腫瘤變異過程表達(dá)逐漸升高，對腫瘤細(xì)胞生長具有重要意義。Akt主要在細(xì)胞膜中表達(dá)，能夠通過調(diào)節(jié)多種生長信號(hào)調(diào)節(jié)細(xì)胞生物活性[15]。當(dāng)PI3K/Akt被激活時(shí)，能夠整合細(xì)胞因子受體，增加細(xì)胞激活劑PDKI分子的表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞膜上的Akt被某些信號(hào)磷酸化后，能夠增加PI3K相關(guān)激酶表達(dá)，進(jìn)而增加細(xì)胞活力。PI3K/Akt信號(hào)通路是機(jī)體重要生存因子，與缺氧心肌細(xì)胞活性存在關(guān)聯(lián)。Akt為PI3K的下游分子，能夠在THr308點(diǎn)上磷酸化，均屬于灌注補(bǔ)救系統(tǒng)，磷酸化后能夠通過抗死亡補(bǔ)體而減少心肌細(xì)胞凋亡，從而增加存活率[16]。miRNAs能夠調(diào)節(jié)PI3K/Akt活性，例如在神經(jīng)元細(xì)胞中miR-124能夠通過增加PI3K/Akt表達(dá)而改善神經(jīng)元凋亡，保護(hù)腦組織。而在不同疾病中miR-124作用存在差異，惡性腫瘤鼻咽癌中，PI3K/Akt水平升高發(fā)揮促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲作用。在缺氧心肌疾病中，miR-21對PI3K/Akt信號(hào)通路具有活化作用，主要通過抑制缺氧細(xì)胞中FASL活性，增加PI3K/Akt磷酸化表達(dá)而減少缺血心臟疾病產(chǎn)生[17-18]。黃偉等[19]研究表示miR-21模擬物抗心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制在于能夠激活PI3K/Akt表達(dá)，對于恢復(fù)心肌梗死大鼠心功能，降低梗死面積具有重要作用。本文研究通過心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21模擬物后發(fā)現(xiàn)其上調(diào)能夠促進(jìn)PI3K/Akt表達(dá)，從而改善心肌細(xì)胞凋亡。研究機(jī)制可能與PTEN是miR-21靶向因子，miR-21能夠抑制PTEN活性，主動(dòng)調(diào)節(jié)PI3K/Akt參與心肌細(xì)胞生物學(xué)行為，降低內(nèi)源性及外源性凋亡信號(hào)通路表達(dá)，從而減少心肌細(xì)胞凋亡。這與MOOIJ等[20]研究結(jié)果相似。

綜上所述，在缺氧心肌細(xì)胞中通過外源性增加miR-21表達(dá)能夠提高心肌細(xì)胞活性，其作用機(jī)制可能與激活PI3K/Akt信號(hào)及磷酸化有關(guān)。