重癥急性胰腺炎患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p與并發肺損傷的相關性*

沈琪琦 童小文 王偉 吳洪

(上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院，上海 200011)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是急診科常見急腹癥，其中20%的患者為重癥AP(severe acute pancreatitis,SAP)，這類患者病情進展快，極易發生全身性炎癥反應，導致多臟器功能衰竭，病死率較高[1]。肺是AP進展過程中最易受到損傷的器官，研究表明，15%～60%的SAP患者伴有不同程度的急性肺損傷(acute lung injury，ALI)，一周內死亡率超過60%，嚴重威脅患者生命安全[2-3]。對于SAP患者，及早診斷肺損傷的存在并進行針對性治療可改善患者預后，提高存活率，因此尋找有效的診斷標志物具有重要臨床意義。當前隨著分子生物學技術的發展，外周血核苷酸等物質在疾病中的應用價值逐漸受到關注，微小RNA(microRNA，miRNA)是一類參與多種生理活動的非編碼小分子RNA，其可通過調控基因轉錄、翻譯等影響細胞活動及新陳代謝等過程[4-5]。miR-21-3p、miR-22-3p是兩種在胰腺組織內特異性表達的miRNA，其可在胰腺損傷時釋放入血，導致血液中含量升高，檢測其水平可為胰腺損傷及程度的評估提供一定幫助[6-8]。目前miR-21-3p、miR-22-3p水平與SAP并發肺損傷的關系較少有研究報道。本研究通過檢測SAP并發肺損傷患者各指標差異，探討其在SAP并發肺損傷診斷、病情評估及預后中的價值，為SAP的早期治療提供參考。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年7月～2020年2月本院收治的124例SAP患者作為研究對象。納入標準：符合中華醫學會外科學分會胰腺外科學組制定的急性胰腺炎診治指南相關標準[9]，經CT、生化檢查明確診斷；對本研究知情并簽署同意書。排除標準：合并嚴重肝腎功能疾病、心血管系統疾病；合并呼吸系統疾病者；合并自身免疫病、惡性腫瘤者；近期使用非甾體類抗炎藥物者。另選擇50例同期我院進行體檢的健康志愿者作為對照組。患者均進行詳細臨床檢查及生化檢查，參考《急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征診斷及治療指南(2006年版)》中ALI診斷標準[10]，按照是否合并ALI分為單純SAP組(78例)、SAP合并ALI組(46例)。

1.2 方法 收集患者性別、年齡、病因、影像學檢查情況、急性生理學與慢性健康狀況Ⅱ(APACHEⅡ)評分等資料。

1.3 標本采集及RNA提取 各組受試者均采集晨起空腹靜脈血，保存于EDTA抗凝管內，采用北京百泰克生物技術有限公司全血RNA試劑盒(RP1101)提取RNA，采用變性膠檢測RNA質量，采用微量分光光度計檢測濃度，保存備用。實時熒光反轉錄定量PCR：①逆轉錄：采用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒(K1621)合成cDNA。②PCR：引物序列miR-21-3p：sense(5′-ATCGTAGCTACTAGTACGTG-3′)，antisense(5′-GCATGCTCATGAGCATCG-3′)；miR-22-3p：sense(5′-CATTCAGCCAGTCTCCACGTGA-3′)；antisense(5′-GCTTCCAGTGATACGGCCTGT AACG-3′)；內參U6：sense(5′-CTCGCTTCGGCAG CACA-3′)；antisense(5′-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3′)。反應體系：20 μL體系，TaqMan GE MASTER Mix 10 μL、產物1 μL、引物1 μL、補無RNA酶水至20 μL。反應程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s, 72 ℃ 20 s，40Cycle。以內參U6表達量作為參照，計算ΔCt值，ΔCt=目的擴增Ct值-內參Ct值，以2-ΔΔCt表示為目的產物的表達水平。

1.4 統計學分析 采用SPSS19.0進行數據處理與統計學分析，計數資料以頻數及率表示，組間比較行2檢驗或Fisher精確檢驗，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較行獨立樣本t檢驗；采用Logistic多因素回歸分析ALI發生的影響因素，繪制受試者特征工作曲線(ROC)分析指標診斷價值，P<0.05為差異具統計學意義。

2 結果

2.1 各組患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達情況 單純SAP組、SAP合并ALI組患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p顯著高于對照組(P<0.05)；SAP合并ALI組高于單純SAP組(P<0.05)，見表1。

表1 各組患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達情況

2.2 不同臨床資料分級患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達情況 不同CT分級、伴有胸水與否、APACHEⅡ評分患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p水平比較差異具統計學意義(P<0.05)；CT分級為E級、合并胸水、APACHEⅡ評分≥15分患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p水平高于CT分級為D級、無胸水、APACHEⅡ評分<15分的患者(P<0.05)，見表2。

表2 不同臨床資料患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達情況

2.3 SAP患者并發ALI的影響因素分析 根據外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達水平，以兩者中位值分別作為截點值，將miR-21-3p、miR-22-3p分別分為高表達組、低表達組；以是否并發ALI(否=0，是=1)作為因變量，以患者年齡(<50歲=1，50歲=2)、性別(男性=1，女性=2)、病因類型(膽源性=1，酒精性=2，高脂血癥=3，其他類型=4)、CT分級(D=1，E=2)、胸水(無=1，有=2)、APACHEⅡ評分(<15分=1，15分=2)、外周血miR-21-3p(低表達=1，高表達=2)、miR-22-3p表達水平(低表達=1，高表達=2)等資料作為自變量進行Logistic回歸，CT分級、胸水、外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達水平與SAP患者并發ALI相關(P<0.05)，見表3、4。

2.4 外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達診斷ALI發生的價值 繪制外周血miR-21-3p、miR-22-3p診斷ALI發生的ROC曲線，兩者單獨診斷的曲線下面積(AUC)為0.770、0.812，當截點值為2.668、1.815時，約登指數最大，兩者聯合診斷AUC為0.869，見圖1、表5。

表4 SAP并發ALI的多因素分析

圖1 外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達診斷ALI的ROC曲線

表5 外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達診斷ALI發生的價值

3 討論

miRNA分子小，在血液中均勻分布，穩定且較易被檢測，明確其水平在疾病中的變化可為疾病診斷及評估提供一定參考[11-12]。目前SAP導致肺損傷的發生與胰酶的激活、炎癥介質釋放等作用相關，炎癥反應在兩者發病過程中均占據重要地位[13-15]。miR-21-3p是介導炎癥反應相關的基因調節的miRNA，吳仕燕等[16]開展的一項研究證實血清miR-21-3p水平與膿毒癥患兒急性腎損傷密切相關，其可能通過調控機體炎癥反應對器官產生影響；國外有研究表明，miR-21-3p在胰腺組織中存在高度特異性表達，在胰腺炎發生時，胰腺細胞受損，可促使細胞釋放miR-21-3p，其表達升高，而細胞狀態也可導致miR-21-3p主動或被動釋放入血液中，引起外周血miR-21-3p水平的升高[17-18]。miR-22-3p是哺乳動物常見miRNA，見于多種細胞及組織內，既往有研究表明，miR-22-3p等多種miRNA表達異常與炎癥反應發生相關[19]。本研究結果顯示，與對照組比較，SAP組患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達明顯升高，且合并ALI的患者表達量更高，提示外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達量可能與胰腺炎的發生及程度相關。CT分級、APACHEⅢ均為反映SAP患者嚴重程度的指標[20-21]。本研究探討了不同臨床資料SAP患者各指標表達差異，結果顯示CT分級較高，APACHEⅡ評分較高，存在胸水的患者各表達量較高。這一結果進一步證實外周血miR-21-3p、miR-22-3p表達量與胰腺炎的發生及程度密切相關。另外多因素分析結果也提示在校正其他因素后，外周血miR-21-3p、miR-22-3p水平與SAP患者ALI的發生存在一定關系。Dixit等[22]開展的一項動物研究表明，在小鼠AP模型中，可檢測到miRNA-21-3p表達量的明顯升高；吳開李等[23]開展的一項臨床研究也證實AP患者外周血miRNA-21-3p表達量升高，其水平可作為診斷及預后評估指標；孫月玲等[24]證實在AP患者中也存在miR-22-3p表達量的升高，且其與SAP患者ALI并發相關。本研究在前人研究結果基礎上進一步證實SAP患者miR-21-3p、miR-22-3p表達與ALI的發生密切相關。

外周血miR-21-3p、miR-22-3p水平與SAP患者嚴重程度及是否并發ALI密切相關，分析其水平或可明確SAP患者臟器衰竭情況，可幫助臨床醫師及時確定治療方案，提高治療效果。本研究繪制指標診斷ALI發生的ROC曲線，結果顯示外周血miR-21-3p、miR-22-3p水平診斷SAP并發ALI的AUC均大于0.75，提示兩者對于ALI的發生有一定診斷價值，另外兩者聯合診斷AUC更大，在臨床中可檢測兩者水平并進行聯合診斷。目前較少有研究報道miR-21-3p、miR-22-3p水平對SAP并發ALI的診斷價值，本研究結果可為臨床提供一定參考。本研究存在一定局限性：樣本量較少，對患者臨床資料收集不全面，在進行多因素分析時可能存在較大偏移。

4 結論

SAP患者外周血miR-21-3p、miR-22-3p與ALI并發密切相關，臨床可檢測其水平明確SAP程度及是否發生ALI等器官功能衰竭；外周血miR-21-3p、miR-22-3p明顯升高的患者需考慮ALI的發生，早期明確診斷并給予針對性干預能提高患者預后。