基因突變與轉移性腎透明細胞癌患者VEGF靶向治療預后的關系

劉睿 張銘鑫 李丹 梁曄 梁志娟 王麗萍 牛海濤

(青島大學附屬醫院泌尿外科，山東 青島 266003)

腎細胞癌是人類最常見的惡性腫瘤之一[1]，全世界每年新確診的患者超過30萬，其中腎透明細胞癌(ccRCC)占腎細胞癌的70%～85%，死亡率也最高[2]。近年來，隨著治療技術的不斷發展，靶向治療已經成為晚期腎癌患者除手術外的常規治療方案。目前美國食品藥物監督管理局(FDA)批準的一線治療方案主要有舒尼替尼、帕佐帕尼等[3]，其中晚期腎癌臨床最常用的是以血管內皮生長因子受體(VEGFR)為靶點的藥物，如舒尼替尼和索拉非尼等。另外，隨著對腎癌基因組學的研究發現，某些基因如PBRM1、BAP1和SETD2等的突變能夠抑制腫瘤的進展[4]，但目前尚不清楚這些基因突變與VEGF靶向治療臨床反應的相關性。為了進一步研究ccRCC基因突變與患者VEGF靶向治療反應之間的相關性，本研究收集了轉移性ccRCC患者的腫瘤組織標本，通過全外顯子組測序分析高頻突變基因在轉移性ccRCC患者VEGF靶向治療中的臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取我院15例轉移性ccRCC患者進行全外顯子測序。納入標準：轉移性ccRCC患者，且進行了舒尼替尼或索拉非尼靶向治療。同時選取TCGA數據庫中符合納入標準的轉移性ccRCC患者5例，納入其全外顯子組測序結果。共20例接受一線VEGF靶向治療的ccRCC患者被納入本研究，患者中男17例，女3例。患者中位隨訪時間為3年,中位無進展生存期(PFS)為14.5個月。有11例患者從診斷到接受靶向治療的時間小于1年。其中IMDC風險分層低、中、高度風險的患者分別為3、14和3例。使用索拉非尼和舒尼替尼的患者分別為15、5例。有3例患者曾接受過免疫因子治療。腫瘤最常見的轉移部位是肺和淋巴結。本研究獲得青島大學附屬醫院倫理委員會的批準(審批號：QDFYWZLL26239)，并嚴格按照《人類和動物權利聲明》以及《赫爾辛基宣言》的要求進行相關研究工作。

1.2 全外顯子測序方法

1.2.1石蠟標本DNA的提取 取患者術中切除的腎癌病理組織制成的石蠟切片，進行脫蠟并以無水乙醇干燥。用石蠟樣本DNA提取試劑盒(MagMax FFPE DNA/RNA Ultra Kit,cat# A31881, Thermo Fisher)在全自動核酸提取儀 (Thermo Fisher)上提取DNA并純化。

1.2.2全外顯子測序樣本庫的制備 將純化后的DNA在超聲波破碎儀(Covaris S220 sonicator)上打斷為長度小于350 bp的片段；用核酸純化試劑盒(AMPureXP，cat#A63881,Agencourt/Beckman) 磁珠純化后加上接頭的DNA片段；通過Herculase Ⅱ Fusion HS DNA聚合酶系統進行捕獲前PCR預擴增并同時添加引物；隨后，在PCR儀上進行外顯子雜交捕獲(65 ℃ 1 min，37 ℃ 3 s，循環60次)；利用鏈霉親和素磁珠(T1 Steptavidin magnetic beads)凈化提純捕獲到的DNA外顯子庫；最后，進行捕獲后PCR擴增并再次用磁珠(AMPure XP)凈化提純。

1.2.3全外顯子測序及基礎變異分析 將制備好的全外顯子DNA庫在測序儀(Illumina NovaSeq-6000)上進行測序。測序原始照片用RT3(Illumina)軟件進行堿基識別，然后用cutadapt程序進行適配性調整，用Sentieon(San Jose, CA, USA)軟件集成環境濾去低質量讀數量，并調用BWA算法與NCBI hg19人類參考基因組比對，GATV 3.5軟件處理后得到患者全外顯子序列。VarscanIndel, CNVnator軟件分別得到患者的單核苷酸變異、插入缺失和拷貝數變異等基因突變數據。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行有關統計學分析，采用Kaplan-Meier方法對PFS進行分析，并且基于Logrank檢驗對基因變異情況進行比較。結合風險標準和突變狀態，利用Cox回歸評價突變型(MT)與野生型(WT)患者發生腫瘤進展概率的比值即風險率(HR)。

2 結 果

本研究結果顯示，突變率最高的基因為VHL(55%)，其次為BRM1(35%)，后依次為SETD2(20%)、PRDM16(15%)和BAP1(15%)。見圖1。為了保證數據分析的準確度，本研究僅選取了研究隊列中突變頻率≥5%的基因進行分析，其中VHL和PBRM1基因的突變頻率與TCGA數據庫中的結果基本吻合，而BAP1和SETD2基因的突變頻率較TCGA數據庫中相關基因的突變頻率高。同時，在本研究中被發現的具有較高突變頻率的PRDM16基因在TCGA數據庫中的突變率較低，僅為0.6%。

圖1 入組患者高頻突變基因分布情況

本組患者PFS為3～32個月，大部分患者的PFS小于20個月。VHL、SETD2、BAP1、MTOR以及ARID1A基因突變與患者PFS無明顯關聯。PBRM1基因MT患者的中位PFS較WT患者明顯延長(χ2=5.45,P<0.05；HR=0.34,95%CI=0.12～0.96)。PRDM16基因MT患者的PFS較WT患者明顯延長(χ2=8.22，P<0.05；HR=0.09，95%CI=0.01～0.76)。見表1。

表1 患者PFS、HR與基因突變的關系

3 討 論

近年來已有多種VEGF靶向藥物用于ccRCC的一線治療，臨床獲得明顯療效。本研究通過全外顯子測序技術探討轉移性腎透明細胞癌的基因突變與患者VEGF靶向治療預后的相關性，為VEGF靶向治療提供與預后相關的基因突變標志物。

本研究結果顯示，PBRM1和PRDM16基因突變與患者VEGF靶向治療預后相關聯。研究顯示PBRM1和PRDM16基因突變參與了HIF-VEGF軸的調控過程[5-6]，而BAP1與SETD2基因突變頻率增加可能與ccRCC患者的晚期進展有關[7-8]。本研究中VHL基因突變對患者預后無明顯影響，迄今為止對VHL基因突變和VEGF靶向治療預后關系的研究結論并不一致，可能還需要深入研究進行驗證[9-12]。在ccRCC中，VHL基因是HIF軸最常見的調控因素[13]，而HIF是影響腎癌發展的關鍵因素，其靶基因編碼包括VEGF在內的多種可以促進腎癌發生和進展的蛋白質，而HIF積累會導致VEGF調節失控，進而促進腫瘤血管化程度的升高。

PBRM1是晚期ccRCC中最常見的突變基因，其編碼的含溴結構域蛋白BAF180參與多種DNA修復過程，而PBRM1基因突變通常表現為基因表達的缺失[14]。在腎癌細胞系當中HIF-1α蛋白表達缺失非常常見，而HIF-1α缺失的細胞系主要通過HIF-2α調節VEGF產生[15]。因此當HIF-1α不表達時，PBRM1作為HIF-1α和HIF-2α的共同激活因子會誘導HIF-2α的表達，進而促進腫瘤生長[16]。已有研究表明，PBRM1基因突變在局限性和晚期腎癌中具有不同的作用，在局限性腎癌中PBRM1基因突變會導致預后不良，而在晚期腎癌中則與預后良好相關[17]。一份來自RECORD Ⅲ的臨床試驗報告表明，PBRM1基因的突變可能是一種靶向治療預后良好的預測標志物[6,12]。本研究的結果顯示，PRDM16基因突變與患者PFS延長有關。研究表明PRDM16基因可以通過抑制HIF的靶基因SEMA5B來下調VEGF的表達，從而抑制腫瘤的生長和侵襲[18]。通常，腎癌組織中的PRDM16基因甲基化水平會發生明顯升高，導致其表達量較正常組織顯著下降[19]。這會導致腎癌組織中本應被PRDM16基因產物抑制的下游HIF應答基因SEMA5B被激活，而激活的SEMA5B基因則會通過促進VEGF表達來支持體內腫瘤的生長[5]。由此我們推測PRDM16基因突變可能改變了其啟動子區域的甲基化修飾狀態，解除腎癌組織中PRDM16沉默。總之，以上研究揭示了PBRM1和PRDM16對VEGF表達的分子調控機制。

本研究中仍存在著一些局限性：①腫瘤的異質性。這是一個重要的混雜因素，本研究僅對所選取的20例患者全外顯子組測序結果進行分析評估，無法識別腫瘤進化過程中的所有驅動因素。一項針對原發性腎癌的多核心活檢研究指出，要保證腫瘤基因分型的準確性至少需要在3個不同的腫瘤區域進行采樣[20]，然而這在常規的臨床工作中比較困難。②納入本研究的患者存在接受多種靶向藥物治療的情況。雖然收錄使用多種VEGF靶向藥物治療的樣本會增加結果的異質性，但這種分布卻也更符合臨床治療中患者的實際情況。③樣本數量限制。雖然在本次研究中得出了一些具有統計學意義的結論，但樣本數量有限，希望以后這些結論可以在更大的樣本中得到進一步驗證。

綜上所述，本研探索ccRCC中VEGF靶向治療預后和基因突變之間的關系，發現PBRM1以及PRDM16基因突變與轉移性腎透明細胞癌VEGF靶向治療預后良好密切相關，有助于指導臨床治療中VEGF靶向藥物的應用。雖然本研究僅闡明了以上基因突變與患者VEGF靶向治療之間的潛在聯系，但在基因突變的基礎上預測靶向治療效果并篩選預后良好標志物，有助于為患者選擇最佳個體化治療方案，從而為ccRCC患者的臨床靶向治療提供一定的理論指導和依據。