基于環介導等溫擴增技術的巴戟天檢測方法的建立

王姝涵 隋愛華 韓亞斐 周泉 許行 姚如永

(青島大學附屬醫院醫學研究中心，山東 青島 266003)

巴戟天(MorindaofficinalisHow)為茜草科巴戟天屬藥用植物，主產于廣東、廣西等地[1]。其干燥根作為四大南藥之一，在傳統中醫藥中具有補腎陽、強筋骨、祛風濕等功效[2]。巴戟天的活性成分主要為環烯醚萜苷、蒽醌和糖類等[3-5]，具有抗不孕不育、抗抑郁和抗骨質疏松等作用[6-9]。常與巴戟天混淆的藥材羊角藤、鐵箍散、虎刺等在外部形態上與巴戟天極為相似，但藥用價值和有效成分差異很大，選擇不當將引起不良反應，影響臨床用藥安全[10]。根據藥典標準，巴戟天的鑒定方式為顯微鑒別、色譜分析等[11]，但這些鑒定方式存在靈敏度不夠、耗時較長、設備昂貴等弊端[12-13]，因此臨床迫切需要一種靈敏、快速、成本較低的巴戟天鑒定技術。環介導等溫擴增(LAMP)技術是一種較為新穎的核酸擴增技術，由NOTOMI等[14]于2000年建立。在特異性引物、鏈置換型DNA聚合酶的作用下，靶基因于恒溫條件15～60 min即可完成擴增反應[15]。加入熒光染料可通過明顯的顏色變化客觀判定檢測結果[16]，通過實時濁度儀或實時熒光定量儀可對反應過程進行實時定量監測[17]。目前LAMP檢測已廣泛應用于臨床診斷、病原體檢測、病蟲害排查等[18-20]，但尚未見巴戟天LAMP檢測相關的研究報道[21]。DNA條形碼是一種常用的分子鑒定工具，廣泛應用于植物鑒定[22-23]。巴戟天二級內部轉錄空間(ITS2)序列是該物種最具特異性的標記序列之一，具有高度種間變異性和區分度[24-25]。本研究擬建立一種基于LAMP技術針對巴戟天ITS2序列的簡便、快速、價廉檢測方法，為巴戟天DNA分子鑒定提供新方式。

1 材料與方法

1.1 材料

選取巴戟天及與其外形或基因相似度較高的7種藥材，分別為羊角藤(MorindaumbellataL.)、虎刺(Damnacanthusindicus)，鐵箍散(Schisandrapropinquavar.Sinensis)、海濱木巴戟(Morinda

citrifoliaL.)、雞眼藤(Morindaparvifolia)、白木通(Akebiatrifoliatasubsp.Australis)、南五味子(KadsuralongipedunculataFinetetGagnep)。巴戟天及其相似藥材均來自青島大學附屬醫院中藥房，并經專業醫師按藥典標準進行鑒定，使用前均置于干燥環境下常溫貯存。

1.2 DNA提取

將上述藥材磨成粉末，并按照Sangon Biotechs Ezup柱式植物基因組DNA提取試劑盒的說明書要求的步驟分別提取總DNA，使用QuickDrop分光光度計檢測所提取DNA的純度和濃度。選出A260/A280比值高于1.80的DNA提取液，經TE緩沖溶液稀釋使其終濃度為10 mg/L，置于-20 ℃保存備用。

1.3 生物信息學分析

在NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov)的GenBank數據庫中，通過Blast分析篩選出與巴戟天ITS2序列相似度>90%的基因序列，然后使用MEGA 7軟件進行1 000次最大似然樹比對，確定巴戟天LAMP檢測的最適ITS2靶標序列，用于后續引物設計。

1.4 引物設計

根據生物信息學分析結果，利用在線引物設計軟件Primer Explorer 5.0 (http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設計LAMP引物，將符合標準的引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物設計的標準為：GC含量范圍為40%～60%，預測的熔化溫度(Tm)范圍為0～65 ℃，ΔG≤4 kcal/mol。引物序列見表1。

表1 巴戟天LAMP檢測引物

1.5 最適反應溫度的確定

按照Loopamp?DNA熒光目視等溫擴增試劑盒的說明書冰上制備25 μL反應混合體系，其中的DNA提取液濃度為10 mg/L。于該體系中加入1 μL鈣黃綠素作為目視檢測的反應體系，混勻后使用水浴鍋在58 ℃、60 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、66 ℃、68 ℃的反應溫度下分別進行LAMP擴增反應。擴增60 min后，80 ℃滅活10 min。擴增成功的判斷標準為原橘色反應液肉眼觀察變為綠色。根據綠色的深淺判斷最適反應溫度，綠色越深，說明產物的量越多，反應溫度越適宜。

同時以實時熒光定量方法檢測擴增時的熒光強度，驗證基因擴增結果。制備上述25 μL反應混合體系，體系中加入1 μL SYBR GREEN Ⅰ(北京索萊寶科技有限公司)作為實時定量檢測的反應體系，混勻以后使用熒光定量PCR儀(LineGene 9600，杭州博日科技有限公司)在58 ℃、60 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、66 ℃、68 ℃的不同循環段溫度下分別進行LAMP擴增反應。條件設置為循環段：60個循環，每個循環1 min；熔解段：80 ℃循環10 min。擴增成功的判斷標準為反應時有擴增曲線生成。根據曲線到達的熒光強度判斷最適反應溫度，熒光強度數值越高，說明產物的量越多，反應溫度越適宜。

1.6 特異性檢測

將巴戟天與羊角藤、虎刺、鐵箍散、海濱木巴戟、雞眼藤、白木通、南五味子的DNA提取液及TE緩沖溶液(陰性對照)，按照1.5所述方法，并使用最適反應溫度進行擴增，同時進行目視以及實時定量LAMP檢測，評價該方法的特異性。

1.7 靈敏度檢測

將濃度10 mg/L的巴戟天DNA提取液稀釋至100.00、10.00、1.00、0.10、0.01 μg/L后按照1.5所述方法，同時進行目視及實時熒光定量LAMP檢測，確定LAMP的靈敏度。

將稀釋為100.00、10.00、1.00、0.10、0.01 μg/L的巴戟天DNA提取液按照TaKaRa Ex Taq?DNA聚合酶的說明書進行常規聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，擴增引物使用表1中F3和B3各40 pmol，終體積為25 μL。用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳成像法檢測水浴LAMP方法擴增結果和常規PCR方法擴增結果，比較兩種方法的靈敏度。擴增成功的判斷標準為凝膠上有條帶產生，其中LAMP方法擴增的條帶為梯形特征條帶，PCR方法擴增的條帶為200～300 bp間顯示的常規條帶。

2 結 果

2.1 物種比對結果

最大似然樹比對結果顯示，巴戟天AB715224序列獨立聚為一支，與其他物種進化距離較遠，物種分離清晰，說明這一序列具有良好的物種鑒別能力。見圖1。圖中物種名稱后面括號內為所對應的基因序列號，連線處的數字為置信度。

圖1 巴戟天及近緣植物基于ITS2序列的最大似然樹

2.2 巴戟天LAMP檢測的最適反應溫度篩選結果

目視檢測結果顯示，反應溫度為58 ℃時反應液顏色顯示為橘色，沒有擴增成功。其余反應溫度時反應液均為綠色且顏色相近，說明擴增成功但無法判斷出最適反應溫度。見圖2A。實時熒光定量分析結果顯示，反應溫度為63 ℃時曲線顯示擴增最明顯，擴增的熒光強度最高。由此確定巴戟天LAMP檢測在58～68 ℃范圍內的最適反應溫度為63 ℃。見圖2B。

A：目視檢測結果，B：實時熒光定量檢測結果圖2 巴戟天LAMP檢測最適反應溫度篩選

2.3 巴戟天LAMP檢測的特異性結果

巴戟天與其他7個物種的LAMP目視檢測結果顯示，陰性對照與其他物種的反應液均為橘色，顯示沒有擴增。含有巴戟天DNA的反應液由橘色變為綠色，說明擴增成功。見圖3A。實時熒光定量分析結果顯示，陰性對照與其他物種無擴增曲線生成，顯示沒有擴增。含有巴戟天DNA的反應液生成了擴增曲線，說明擴增成功。見圖3B。

A：各物種的目視檢測結果，B：各物種的實時熒光定量檢測結果。其中1～9分別為陰性對照、巴戟天、羊角藤、虎刺、鐵箍散、海濱木巴戟、雞眼藤、白木通、南五味子圖3 各物種LAMP檢測結果

2.4 巴戟天LAMP檢測的靈敏度

目視檢測結果顯示，巴戟天DNA提取液的濃度為0.01 μg/L時反應液顏色顯示為橘色，沒有擴增成功。其余濃度的反應液均由橘色變為綠色，說明擴增成功。見圖4A。實時熒光定量分析結果顯示，巴戟天DNA提取液的濃度為0.01 μg/L時無擴增曲線生成，顯示沒有擴增。其余濃度均生成了擴增曲線，說明擴增成功。見圖4B。由此確定巴戟天LAMP檢測的最低檢測限約為0.10 μg/L

A：目視檢測結果，B：實時定量檢測結果圖4 不同濃度巴戟天DNA提取液的LAMP檢測結果

凝膠電泳成像檢測結果顯示，常規PCR方法擴增巴戟天DNA提取液的濃度為0.10 μg/L，無條帶產生，沒有擴增成功；其余濃度在200～300 bp間產生條帶，說明擴增成功。見圖5A。LAMP方法擴增巴戟天DNA提取液的濃度為0.01 μg/L時，無條帶產生，沒有擴增成功；其余濃度均生成了梯形條帶，說明擴增成功。見圖5B。因此可以確定巴戟天常規PCR檢測的最低檢測限約為1.00 μg/L。

A：常規PCR方法擴增檢測結果；B：LAMP方法擴增凝膠電泳成像檢測結果。其中1～5分別為100.00、10.00、1.00、0.10、0.01 μg/L，M為DNA marker圖5 不同濃度巴戟天DNA提取液的凝膠電泳成像檢測結果

3 討 論

包含中藥及其提取成分的醫藥產品在疾病的預防和治療中的使用越來越廣泛，誤用、混用和假冒中藥將嚴重影響臨床用藥安全[26]。本研究從基因角度基于LAMP技術建立簡便快捷、特異性強、靈敏度高的巴戟天檢測方法，為巴戟天分子鑒定提供新的檢測思路，解決了巴戟天及其表型與其相同、化學成分較相似的近緣物種鑒定困難的問題。

本研究基于巴戟天ITS2序列設計引物，該序列具有序列分歧度最小、遺傳變異系數最大、序列較為保守的特征[27]。最大似然樹比對結果顯示，ITS2序列在巴戟天的系統研究和種屬鑒定方面具有很大潛力，可能是最適合巴戟天種屬的鑒定序列。

根據實驗結果，巴戟天LAMP檢測的最適反應溫度為63 ℃，而且僅需水浴60 min左右即可完成對巴戟天DNA的擴增，反應完成后生成大量核酸并產生明顯的顏色變化，檢測結果清晰客觀。因此巴戟天LAMP檢測可簡單有效地依據試管內反應液顏色變化進行目視定性檢測，克服瓊脂糖凝膠電泳檢測結果易被污染且檢測步驟繁瑣的缺點。

巴戟天及其近緣物種LAMP檢測的特異性實驗結果證明，巴戟天可在本研究選擇的樣本范圍內成功檢測出巴戟天，具有較好的特異性。因此，該方法的應用性良好，可為茜草科植物的中藥檢測方法研究提供一定的參考價值。

根據靈敏度檢測結果，該方法的最低檢測限約為0.10 μg/L，約為常規PCR方法最低檢測限的十分之一，顯示了較高的靈敏度。這一結果提示，巴戟天LAMP檢測方法有不低于同類型分子檢測方法的靈敏度。

本研究的不足之處在于，植物尤其是含水、含糖量較多的植物，其DNA提取過程有時比較困難，而在分子檢測領域的分析過程中，DNA提取失敗等問題會影響檢測靈敏度[28-29]。保證DNA提取質量，進一步探索高質量、高效率提取植物DNA的技術方法，是需要著力解決的方向之一。

綜上，巴戟天LAMP檢測具有良好的特異性、靈敏度和應用性，同時適配于PCR相關設備，根據凝膠成像和實時熒光定量擴增曲線得到半定量和定量的結果。因此該方法可利用現有各類設施，適合各級各類藥品檢測機構，應用前景廣闊[30]，下一步可結合側向流試紙條開發巴戟天即時檢測(POCT)試劑盒以推廣使用[31]。