七氟烷對心肌缺血再灌注損傷模型大鼠心肌的保護作用及其機制

白雪 宋思宜 郭海燕 趙洋 王士雷 李瑜

(青島大學附屬醫院麻醉科，山東 青島 266003)

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是臨床常見的病理過程，是冠心病發病以及心肌血運重建治療過程中心肌損傷的核心環節，如何減輕缺血再灌注損傷一直是國際研究的熱點之一。七氟烷是目前臨床應用最為廣泛的吸入性麻醉藥。研究發現，圍手術期吸入七氟烷對心肌有保護作用[1-2]。隨著研究的深入，SARKAR等[3]證實七氟烷后處理(SPC)可調節圍手術期患者心血管系統的功能，如增加心肌收縮力、減輕MIRI所致心肌梗死等。在糖尿病大鼠受損的心肌組織中，SPC可顯著上調HIF1α及其下游遞質血管內皮生長因子蛋白的表達,減少心肌梗死面積，改善心臟功能[4]。研究表明，HIF2α可以誘導雙調蛋白(AREG)的表達[5]，該研究首次提出心肌細胞特異性HIF2α能增加心肌缺血耐受性，并且AREG可抑制HIF2α缺失小鼠的MIRI。但七氟烷對心肌細胞的保護作用是否與HIF2α-AREG通路有關，目前尚不明確。本研究通過構建大鼠MIRI模型，檢測經不同方式處理的大鼠血流動力學、心肌梗死面積的變化，以及大鼠心肌組織中促凋亡蛋白Bax及抗凋亡蛋白Bcl-2表達的變化，探討七氟烷對心肌細胞的保護作用及其與HIF2α-AREG通路的相關性。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 成年清潔級雄性SD大鼠45只，體質量280～320 g，由山東省實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK(魯)20140007。實驗前大鼠于安靜環境下，24 ℃恒溫飼養3～4 d，正常飲食，12-12 h明暗交替光照。所有大鼠實驗前12 h禁食不禁水。

1.1.2主要試劑及實驗設備 AREG蛋白購自加拿大Biomatik公司，PT2385購自美國MCE公司，兔抗大鼠Bax、Bcl-2抗體購自武漢三鷹公司，正置白光顯微鏡(日本Olympus公司)，HX-100E小動物呼吸機購自成都泰盟科技有限公司。蛋白電泳系統購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1動物分組及處理 根據處理方法不同將大鼠隨機分為A、B、C、D、E組，每組9只大鼠。

A組在MIRI模型制備過程中[6]，分離出左冠狀動脈前降支(LAD)后，在LAD下方穿線但不結扎，觀察160 min；B組在建立大鼠MIRI模型后，結扎LAD 40 min，隨后松開結扎線再灌注120 min；C組在B組操作的基礎上，再灌注開始時大鼠先吸入體積分數0.024的七氟烷15 min，然后停止吸入七氟烷繼續再灌注105 min；D組于MIRI模型制備前1 h先腹腔注射HIF2α阻滯劑10 mg/kg，其后操作同C組；E組大鼠于LAD結扎前15 min經頸內靜脈注射AREG蛋白50 μg，其余操作同D組。處理過程中每組隨機選取5只大鼠，分別檢測缺血前、缺血15 min及再灌注2 h末的心率和血壓。

1.2.2標本處理及各項指標的檢測 ①上述各組大鼠處理結束后，每組隨機選取3只大鼠切取的心尖組織，HE染色后，顯微鏡下觀察心肌細胞的形態；②每組再隨機選取3只大鼠，均再次結扎LAD后，在頸內靜脈注射伊文斯藍溶液3 mL，當大鼠眼睛內出現伊文斯藍時，快速取下心臟，保留左心室部分，生理鹽水沖洗后，于-80 ℃冰箱冷凍后切薄片，TTC染液脫色，置于37 ℃水浴箱中15 min，然后用組織固定液固定過夜，分離左心室和梗死部分(白色部分)并分別稱質量,比較各組大鼠心肌梗死質量占左心室質量的比值；③每組取剩余3只大鼠，快速取下心臟，切取包含心尖的1/3體積心臟，去掉右心室，保留左心室部分，稱質量。用組織裂解液裂解組織，獲取組織液，離心后取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。以40 μg蛋白量計算每組的上樣體積,加入上樣緩沖液,煮沸變性，并按照Western Blot試劑盒說明書進行操作；封閉結束后，分別加入兔抗大鼠單克隆抗體Bax(稀釋比1∶5 000)、Bcl-2(稀釋比1∶4 000)4 ℃孵育過夜；次日洗膜以后加入二抗，室溫孵育以后加入顯影液，采用凝膠成像儀觀察。用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白的條帶灰度值表示目的蛋白的表達水平，計算各組大鼠的Bax/Bcl-2比值。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 各組大鼠心率及平均動脈壓變化

時間、分組、時間與分組交互作用對大鼠心率無明顯影響(P>0.05)，對大鼠平均動脈壓有明顯影響(F時間=101.41，F組間=10.23，F交互=6.93，P<0.05)。各組缺血前心率及平均動脈壓比較差異無顯著性(P>0.05)。除A組外，其余各組大鼠不同時間點平均動脈壓比較差異有顯著性(F=16.07～34.08，P<0.05)，其中各組大鼠缺血15 min和再灌注2 h末與缺血前平均動脈壓相比均具有明顯下降(P<0.05)，C組和E組再灌注2 h末平均動脈壓較缺血15 min時明顯上升(P<0.05)。再灌注2 h末，與B組相比，C、E組平均動脈壓均有明顯上升(F=13.62，P<0.05)，而D組與B組比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠缺血前、缺血15 min及再灌注2 h末心率及平均動脈壓比較

2.2 各組大鼠心肌梗死質量占左心室質量比值

B～E組大鼠的心肌梗死質量占左心室質量比值為0.207±0.003、0.115±0.009、0.207±0.010、0.112±0.008，組間比較差異有顯著性(F=193.26，P<0.05)，其中C、D組與B組及D組與E組大鼠心梗質量占左心室質量比值比較差異有顯著性(t=14.24～20.01，P<0.05)。

2.3 各組大鼠心肌組織Bax/Bcl-2比值比較

A～E組大鼠心肌組織Bax/Bcl-2比值分別為2.56±0.11、20.92±4.37、5.30±0.29、11.34±1.22、3.54±0.34，各組間比較差異均具有顯著意義(F=27.92，P<0.05)，A、C組與B組以及C、E組與D組大鼠心肌組織Bax/Bcl-2比值比較差異有顯著意義(t=5.04～6.79，P<0.05)。

2.4 各組大鼠光鏡下心肌細胞形態比較

光鏡下觀察，A組大鼠心肌細胞排列整齊，無水腫(圖1A)；B組大鼠心肌細胞嚴重水腫，心肌細胞周圍可見炎性細胞聚集，心肌纖維組織周圍紅細胞滲漏(圖1B)；C組大鼠心肌細胞輕度水腫，心肌細胞周圍可見少量炎性細胞聚集，心肌細胞排列比較整齊(圖1C)；D組大鼠心肌細胞水腫、核固縮嚴重，心肌細胞周圍可見大量炎性細胞積聚(圖1D)；E組大鼠心肌細胞水腫程度較輕，心肌細胞排列略為紊亂，心肌細胞周圍炎性細胞聚集不明顯(圖1E)。

A～E分別為A～E組，HE染色法，400倍圖1 光鏡下各組大鼠心肌組織HE染色結果

3 討 論

心肌缺血治療的關鍵是盡快恢復缺血區域的血供，但是再灌注又會產生MIRI。迄今為止，溶栓療法仍然是目前治療急性心肌缺血的有效方法[7]。在心肌缺血期間，心肌組織氧供減少，缺氧嚴重[8]，而低氧誘導因子(HIFs)是低氧適應性轉錄反應的主要調節因子[9]，在心臟適應性反應中發揮著作用，降低心肌梗死的程度[6]，抑制HIFs的降解，從而減輕MIRI[10-11]。遠程缺血預處理對疑似首次心肌梗死的患者具有心肌保護作用[12]，而這一保護作用在敲除了HIF1α基因的小鼠中消失，證明HIF1α在遠程缺血預處理誘導的心臟保護中起著重要作用[13]。

HIF2α是一種由缺氧敏感的HIF2α亞單位與其專一性伴侶亞單位ARNT二聚體形成的異二聚體轉錄因子[14]。研究顯示，HIF2α是肝癌治療的首選靶點[15]，且HIF2α阻滯劑對腎細胞癌早期模型有效[16]。但HIF2α對心肌細胞的影響研究報道較少，并且其與七氟烷在心肌細胞保護作用中的相關性也不是很清楚。KOEPPEN等[5]研究發現，激活HIF2α-AREG通路可抑制小鼠MIRI，改善缺血后數周小鼠的心臟功能，同時在缺血性心肌病患者中AREG表達增強。這些發現表明重組AREG可用于預防性治療心臟手術患者，以增強心肌缺血耐受。因此本研究擬通過建立大鼠MIRI模型來探討七氟烷對心肌缺血的保護作用是否與HIF2α-AREG通路有關，明確七氟烷對心肌保護作用的具體機制。

SPC可以發揮類似于缺血預處理或缺血后處理的心肌保護作用，這是應對圍手術期MIRI損傷的一種非常有效的手段[17-18]。本研究發現C組缺血15 min和再灌注2 h末平均動脈壓均高于B組，且C組心梗質量占左心室質量比值小于B組，表明C組心肌損傷輕于B組，也證實了七氟烷對心肌細胞具有保護作用。而在同樣使用了七氟烷的情況下，加入了HIF2α阻滯劑的D組心梗質量占左心室質量比值大于C組且Bax/Bcl-2比值上調，但是與B組相比差異無顯著性。Bax/Bcl-2比值上調表明細胞趨于凋亡狀態[19]，表明經HIF2α阻滯劑預處理的心肌MIRI的大鼠，即使應用了對心肌組織具有保護作用的七氟烷，心肌梗死仍然加重。由此推斷臨床上使用了HIF2α阻滯劑治療其他疾病的心肌缺血患者，七氟烷對患者的心肌組織可能不能發揮保護作用。與D組相比較，E組心梗質量占左心室質量比值顯著減小，光鏡下心肌細胞的結構更完整且Bax/Bcl-2比值下調，表明E組心肌細胞損傷輕于D組。由此猜測對于正在使用HIF2α阻滯劑治療其他疾病且伴有心肌缺血的患者，雖然七氟烷的心肌保護作用被抵消，但仍然可以考慮應用重組AREG蛋白來減輕MIRI。

綜上所述，SPC能夠減輕大鼠MIRI，減輕心肌梗死面積，改善血流動力學；HIF2α抑制劑可以抵消七氟烷的心肌保護作用，使心肌損傷加劇。而重組AREG則可以改善心功能、增強對血流動力學的保護。但是本研究有一定的局限性，首先，本研究使用的是特定藥物阻滯劑而不是基因操作來阻斷HIF2α；第二，本研究僅采用動物實驗證明了SPC對心肌具有保護作用且該保護作用可以通過HIF2α-AREG通路來實現，沒有進行臨床研究。因此，有必要進一步的臨床試驗研究進行驗證。