基于機器學習的基因組微衛星狀態探測方法綜述

張舒瑩，韓鑫胤，何小雨，袁丹陽，欒海晶，李瑞琳，何佳茵，牛北方*

1.中國科學院計算機網絡信息中心，北京 100190

2.中國科學院大學，北京 100049

引 言

《2020全球癌癥報告》顯示，全球癌癥病例數呈增長趨勢，癌癥已對人類健康產生了重大威脅。探究癌癥的產生原因，可以對癌癥進行預防并且有助于癌癥患者的診斷和治療。研究證實，癌癥源于基因突變的不斷積累，基因突變表現為基因序列上發生改變，包括堿基的點突變、堿基序列的插入和刪除變異等[1]。

人類基因組中有一些特殊的短串聯重復序列，被稱為微衛星（microsatellites，MS）。當MS序列發生插入或刪除突變且無法被修復時，則會產生微衛星不穩定性（microsatellite instability，MSI）現象。1993年，MSI現象在遺傳性結直腸癌中被發現[2]。后續的研究表明，除了結直腸癌外，子宮內膜癌、胃癌、肺癌和食管癌等多種癌癥中均有不同比例的MSI現象發生[3-6]。MSI檢測可以對癌癥患者進行遺傳篩查、預后判斷以及免疫治療等。

目前，已經有多種MSI檢測的方法，包括傳統的生物學實驗方法以及基于高通量測序的方法[7]。隨著人工智能的發展，機器學習逐漸滲入生物信息學領域并發揮巨大作用[8-10]。基于機器學習的MSI檢測方法，借助機器學習的強大學習能力，可以對數據進行多維度的分析，找出影響MSI的主要因素。

1 研究背景

1.1 MSI及其檢測意義

MS是一種以1-6個堿基為單位，重復次數為10-60次的短核苷酸序列[11]。MSI是指在DNA復制過程中由于滑移引起的MS序列長度改變的現象[12]。在正常情況下，細胞中的錯配修復（mismatch repair，MMR）系統可以修復由于滑移導致的堿基錯配，當MMR通路基因發生突變或甲基化則會導致MMR系統出現錯配修復缺陷（deficient mismatch repair，dMMR），此時堿基錯配無法被修復，從而產生MSI[13]。根據不穩定程度，MSI可以劃分為：微衛星穩定性（microsatellite stability，MSS），低頻微衛星不穩定性（MSI-low，MSI-L）和高頻微衛星不穩定性（MSI-high，MSI-H）。在研究中通常將MSI-L作為MSS處理[14-15]。MSI現象在多種癌癥中均有出現，其狀態檢測在臨床上有重要意義。

MSI的檢測在林奇綜合征遺傳篩查中發揮重要作用。林奇綜合征又稱為遺傳性非息肉病性結直腸癌，源于MMR基因發生胚系突變[16]。林奇綜合征具有家族遺傳傾向，該群體患有結直腸癌的概率可達80%[17-18]。除此之外，該群體也易患其它癌癥[19-20]。因此，建議對所有癌癥患者進行MSI檢測，以便篩查林奇綜合征[21]，如果確診林奇綜合征可及早采取治療，并對其直系親屬進行篩查和早期干預。

MSI狀態的檢測還有助于Ⅱ期結直腸癌患者的預后判斷。相對于MSS結直腸癌群體，MSI-H群體的總生存期及無進展生存期有較為顯著的延長[14,22-23]。另有研究表明，對Ⅱ/Ⅲ期結直腸癌患者使用5-氟尿嘧啶藥物會影響其預后，縮短其總生存期[24]。因此，鑒于MSI-H的Ⅱ期結直腸癌患者具有較好預后，不建議對其使用氟尿嘧啶類的藥物進行輔助化療[25]。

MSI是重要的免疫治療生物標志物。MSI-H/dMMR癌癥患者體內攜帶大量的可被免疫系統識別的新生抗原，這使得患者對免疫檢查點阻斷療法敏感[26-27]。大量研究證實，對于MSI-H癌癥患者，使用免疫檢查點抑制劑（PD-1/PD-L1抗體）治療可取得較好的療效[28-30]。MSI已成為重要的免疫治療生物標志物，對患者進行MSI檢測有助于指導患者后續治療。

1.2 常用的MSI檢測方法

常見的MSI檢測方法主要分為兩大類，第一類是傳統的生物學實驗的方法，第二類是基于高通量測序的方法。傳統的生物學實驗方法包括多重熒光PCR法（MSI-PCR）和蛋白免疫組織化學法（MMRIHC）[31-32]。MSI-PCR使用多重熒光PCR結合毛細管電泳的方法，對腫瘤組織和正常組織中分離出的DNA序列進行擴增，比較擴增后的MS位點突變情況，進而判定樣本的MSI狀態。通常檢測的位點是Bethesda panel中的5個MS位點，以及Promega分析系統提出的7個MS位點。MMR-IHC通常檢測腫瘤組織中的4個MMR蛋白表達情況來查看MMR系統是否發生故障，從而判斷樣本MSI狀態。相比于MSI-PCR，MMR-IHC操作較簡單，成本較低，可廣泛應用于臨床檢測中，但其需要人眼閱片計數，受個人主觀因素影響較大。

隨著高通量測序技術的快速發展，以全基因組測序（WGS）、全外顯子組測序（WES）以及靶向測序（TS）為主的高通量數據已納入常規的生物信息學研究中。基于高通量測序的檢測方法比生物學實驗方法具有明顯的優勢：（1）不需要額外的臨床測試和樣本處理，對于不具備生物學實驗條件的團隊也可進行MSI檢測；（2）可同時捕獲多段基因序列，有助于從多個維度評估樣本MSI狀態，極大提高診斷效率和檢測的靈敏性；（3）不同于MSI-PCR只檢測個位數的MS位點，基于高通量測序的檢測方法覆蓋的MS位點數以千計，可以進行更加深入和全面的評估，并且可提供單個MS位點的定量信息。

目前，已發布了多種使用測序數據進行MSI檢測的方法，比如MSIsensor[33]、mSINGS[34]和MANTIS[35]等。其中，MSIsensor已經被成功應用于FDA批準的基于高通量測序的腫瘤檢測方法MSK-IMPACT中[36]。這些方法分別采用卡方檢驗、Z-score和平均距離等傳統的統計學方法評估MS位點穩定性，它們雖然可以判定MSI狀態，但是缺乏多維度的考量。測序數據本身蘊含豐富的生物學信息[37]，傳統的統計學方法無法高效處理復雜的海量數據，可能會忽略某些影響MSI判定的關鍵要素。機器學習作為傳統統計學的延伸，可以從大量的數據中抽取關鍵特征進行迭代學習，并且在此過程中屏蔽復雜的細節。機器學習在MSI的探索中發揮了巨大的作用，同時也為MSI檢測提供了新角度和新思路。

2 基于機器學習的MSI檢測方法

MSI檢測在機器學習領域是一個二分類任務，使用決策樹、支持向量機、邏輯回歸等常用的機器學習算法可以高效的解決此類問題。本文對目前基于機器學習的MSI檢測方法進行了充分的調研，涵蓋了主流的檢測方法，比較了各個方法使用數據集的測序方法和最終采用的機器學習算法，以及該數據集在對應機器學習模型中的檢測效果（表1）。下面將分別介紹這些方法結合機器學習算法進行MSI狀態檢測的流程。

表1 基于機器學習的MSI檢測方法Table 1 MSI detection methods based on machine learning

（1）MSIseq

遠程監測設備，即水庫監測終端（太陽能供電型）。負責采集現場檢測設備檢測到的數據和圖片信息，并通過GPRS網絡將現場信息傳送給監測中心。

MSIseq算法考慮到dMMR會影響單核苷酸替代（single nucleotide substitution，SNS）比率和小片段插入刪除（indel）比率，因此從SNS和indel這兩個突變信息入手，構建了9個待選特征，具體含義如表2中（1-9行）所示，其中括號內表示的是該特征在MSIpred中的標記。

表2 MSIseq和MSIpred的特征Table 2 Features of MSIseq and MSIpred

序號特征含義10Frame_Shift_Del導致ORF偏移的刪除比率11Frame_Shift_Ins導致ORF偏移的插入比率12In_Frame_DelORF沒有偏移的刪除比率13In_Frame_InsORF沒有偏移的插入比率14Missense_Mutation錯義突變比率15Nonsense_Mutation無義突變比率16Silent沉默突變比率17Splice_Site剪接位點的突變比率183’UTR3’UTR區域突變比率193’Flank3’Flank區域突變比率205’UTR5’UTR區域突變比率215’Flank5’Flank區域突變比率22Intron內含子區域突變比率

該研究共收集了526例多癌種的WES突變數據，這些樣本也使用MSI-PCR進行了狀態測定。在實驗中，分別使用決策樹、邏輯回歸、隨機森林和貝葉斯算法，采用k折交叉驗證法（k=5）進行訓練，將驗證結果與MSI-PCR測定的結果進行對照，其一致性分別為98.6%、96.5%、98.1%和96.7%。從結果上看，決策樹模型的準確率最高。

進一步研究發現，在決策樹模型中，特征S.ind對結果的判定取決定性作用，即只需這一個特征就可以將MSI-H和MSS樣本區分開，當S.ind>0.395時，樣本被標記為MSI-H，否則為MSS。出于準確率考慮，該研究最終選取只具有一個特征（S.ind）的決策樹算法進行MSI狀態的檢測，該模型在測試集中的準確性高達98.8%。

該方法選取解釋性較強的決策樹算法構建檢測流程，其輸入的是MAF格式的突變數據，相較于mSINGS等需要BAM格式數據的方法節省了大量的計算資源。從測試結果上看，該方法判定樣本MSI狀態的準確率很高，但是其只使用一個特征參與模型訓練和預測，會產生過擬合現象。

（2）MSIpred

與MSIseq類似，MSIpred也是基于突變信息構建特征。不同的是，為了防止過擬合，MSIpred在MSIseq的9個待選特征基礎上，又新增了13個特征，如表2中所示。其中第1-9行特征與MSIseq的待選特征一致，描述的是SNS和indel信息，10-22行是新增的特征，描述了突變有害程度的關鍵信息。

該方法的輸入同樣是MAF格式的突變數據，可以節省計算資源，提高檢測效率。除此之外，在MSIseq研究的基礎上，選取具有22個特征的支持向量機算法構建檢測流程，彌補了MSIseq的不足之處，減少了過擬合風險。

（3）MOSAIC

MOSAIC從MS位點穩定性出發，根據MS位點的不穩定情況判定樣本的MSI狀態。該方法需要使用腫瘤樣本（Tumor，T）配對的正常樣本（Normal，N）作為參照。首先獲得單個MS位點在T和N中的等位基因分布數據，由于MS位點不穩定會伴隨著MS序列長度發生波動，因此對比T和N中的等位基因支持的reads數即可評估此MS位點的穩定性。

該研究共收集了617例多癌種T-N配對的WES測序數據，根據MSI-PCR的結果將其劃分為兩組，一組為MSI-H的T-N樣本，一組為MSS的T-N樣本，分別對這兩組樣本中的MS位點進行穩定性分析。該研究設定以N中的等位基因分布為基準，如果T中出現在N中沒有的等位基因，則該MS位點為不穩定的位點。該研究使用Fisher精確檢驗評估了每個MS位點在MSI-H和MSS樣本中的區分能力，對在MSI-H樣本中最顯著不穩定的MS位點進行了排名，其中位于DEFB105A/B基因上的chr.8:7679723-7679741位點排在第一位，在該研究中被記作defbsite。

基于以上分析，該研究結合前100個在MSI-H樣本中顯著不穩定的MS位點（包括defbsite）和另外4個待選特征進行分析（表3）。采用決策樹算法進行訓練，并使用留一法進行驗證，篩選可以預測MSI狀態的最佳特征，結果顯示peak_avg和defbsite是最顯著的兩個特征，當只使用這兩個特征進行訓練時，結果準確率達96.6%。

表3 MOSAIC的待選特征Table 3 Features of MOSAIC

該研究對單個MS位點進行穩定性分析，可以提供位點的定量信息，獲得影響樣本MSI狀態的顯著MS位點集合，有助于MSI檢測的后續探索。該方法只適用于具有配對正常樣本（T-N）的情況，如果沒有可參照的正常樣本，則無法使用該方法進行MSI檢測。

（4）MIRMMR

不同于以上三種方法，MIRMMR不再局限于根據MS序列的插入刪除情況來評估樣本MSI狀態，而是從MSI發生的根本原因出發，分析35個MMR通路基因的甲基化水平和突變數據，構建邏輯回歸模型預測樣本狀態。該方法提供5個模塊，其中三個模塊（univariate、stepwise和penalized）代表三種構建模型的策略，另有一個預測模塊（predict）和一個比較模塊（compare）。

Univariate模塊將對每個單變量建立邏輯回歸模型，最終匯集每個單變量的模型供后續使用。Stepwise模塊對特征進行篩選，選擇最佳的特征組合參與訓練。Penalized模塊采用了彈性網絡回歸模型，使用k折交叉驗證的方法尋找最優的參數（k=10），該模塊是MIRMMR默認使用的策略。Predict模塊使用前期訓練好的模型進行預測，給出MSI-H的概率值，由用戶權衡靈敏性和特異性劃分判定MSI狀態的基準線。Compare模塊用來比較不同策略下的結果，繪制出對應的ROC曲線以及計算AUC值。

MIRMMR提供了三種構建模型的策略，用戶可使用多種策略構建檢測模型，驗證檢測結果。MIRMMR的研究對象是35個MMR通路基因，提供了一個不依賴于MS位點檢測MSI的新方法。

（5）MIAmS

MIAmS的檢測流程主要分兩步，第一步是MIAmS_learn，在這一步驟中會對MS位點進行篩選和標注標簽，當MS位點的測序深度不能滿足最小測序深度限制時，該位點會被過濾掉，默認的最小測序深度是300X。第二步是MIAmS_tag，對樣本MSI狀態進行檢測，在這一步中，MIAmS工具提供了兩種檢測模式，第一種借助mSINGS進行評估，第二種使用機器學習的方式進行評估。

mSINGS模式是采用的傳統統計方法，首先借助MSS樣本計算MS位點的等位基因個數的平均數mean和方差SD，以[mean+3×SD]作為當前MS位點的基線，在測試過程中，如果MS位點的等位基因個數超過對應的基線，那么這個位點被判別為不穩定，最終根據樣本中不穩定的MS位點個數在所有MS位點中的占比情況判斷樣本MSI狀態。

機器學習模式默認使用支持向量機模型，可使用classifier參數更改為決策樹、邏輯回歸和隨機森林等模型。該方法是結合MS位點的等位基因穩定和不穩定分布模型對該位點進行評估，每個MS位點會得到一個分數，以樣本中所有MS位點得分的平均值判斷樣本MSI狀態。

MIAmS包含基于傳統統計學以及基于機器學習的兩種檢測方式，并提供友好的圖形化界面對結果進行展示，有助于從多個角度評估樣本MSI狀態。

以上方法使用機器學習算法對MSI狀態檢測進行了多方面的探索。MSIseq和MSIpred使用突變數據構建訓練特征，MSIseq最終只使用MS序列小片段插入刪除情況判定樣本狀態。為了更全面的探究突變對MSI狀態的影響，MSIpred對突變數據進行了更詳細的分類，最終構建了22個特征進行檢測。MOSAIC和MIAmS從單個MS位點出發，檢測MS序列的波動情況評估該位點的穩定性，進而判定樣本狀態。MIRMMR從MSI產生的原因入手，根據MMR通路基因的甲基化水平和突變情況構建機器學習模型預測樣本狀態。總體而言，基于機器學習的MSI檢測方法一般從MSI發生的原因或者MSI伴隨的現象入手，根據MMR通路基因的突變信息或者MS序列區域的插入刪除情況來預測樣本的MSI狀態。

3 結論與展望

本文首先介紹了MSI產生的原因以及其狀態檢測在臨床上的重要性，并對目前常用的檢測方法進行了介紹，歸納了基于高通量測序的MSI檢測方法的優勢。相對于高通量測序方法，傳統的統計學方法無法聚焦MSI發生的分子機制，而人工智能領域的發展為此提供了新的思路。作為人工智能領域重要的分支之一，機器學習可以高效的從海量數據中學習知識，挖掘出影響MSI的要素并對數據進行多維度的分析。本文對目前主流的基于機器學習的檢測方法進行了介紹，各項結果顯示該類方法可以對樣本的MSI狀態進行較為準確的判別。

目前機器學習算法已經廣泛的應用到MSI檢測中，并且取得了很好的檢測效果，但是在臨床應用中仍有探索空間及挑戰：

（1）如何提高檢測方法的適用性。目前多數檢測方法基于WES數據展開，覆蓋的MS位點數量龐大，但當檢測數據是基于小panel的靶向測序數據時，使用該方法進行MSI狀態檢測，檢測結果會產生較大偏差。

（2）如何從外周血中檢測MSI狀態。當前的檢測方法多數采用腫瘤組織測序數據，但是組織活檢具有侵入性，部分患者無法完成檢測。科研人員繼而開展從外周血中檢測MSI狀態，該項研究的主要難點在于外周血中的腫瘤DNA在癌癥早期含量較低[43]，無法精確捕獲MSI信號。

應對以上挑戰是MSI檢測未來發展的方向，也是如何靈活應用機器學習算法助力的新方向。

利益沖突聲明

所有作者聲明不存在利益沖突關系。