寧都黃雞糞便基因組DNA提取方法比較及盲腸微生物組成分析

朱 祺，羅 雯,*，艾佐佐，柴學文，王樟鳳

(1.南昌師范學院 生物系，江西 南昌 330032；2. 江西省地方雞種遺傳改良重點實驗室/南昌師范學院 生物技術研究所，江西 南昌 330032)

寧都黃雞原名“寧都三黃雞”，原產于江西省寧都縣黃石、對坊等南部鄉鎮[1]，至今已有1 500多年的飼養歷史[2]。目前對于寧都黃雞的研究多是關于肉質品質、外貌特征和生產性能等方面，尚未見寧都黃雞腸道菌群的系統分析研究。

腸道微生物是一個相當復雜的微生態系統[3]，而禽類腸道微生物對微生物資源的開發具有重要意義[4]。禽類為腸道微生物提供了生存生長的環境和營養物質[5]，而腸道微生物則通過合成供給宿主所需的營養，輔助消化吸收，抵制潛在有害菌[6]，調節宿主的免疫機能，維持宿主的健康，因此徹底了解腸道微生物組對宿主的影響是非常重要的[7]。動物消化道中微生物群落的多樣性能夠保證腸道微生物區系平衡，維持胃腸道環境相對穩定，并且結腸、盲腸中微生物最多[8]，因此本研究以盲腸為研究對象。

高通量測序技術已成為當前微生物群落多樣性研究的主流方法[9]。要獲得高質量的測序結果，一個重要的條件是提供高質量的DNA、RNA樣品。目前提取樣本基因組的試劑盒很多，但各自的提取效果缺少對比分析。本研究將對基因組質量提取的不同預處理方法和不同試劑盒的提取物質量進行比較，并基于擴增子測序結果對寧都黃雞的盲腸菌群組成結構進行初步探究，從而為進一步探索腸道微生物在寧都黃雞生長中的作用、乃至未來禽微生態制劑的研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雄性72日齡寧都黃雞，同一天出殼，同一條件飼養，均產自于江西省地方雞種遺傳改良重點實驗室家禽分子遺傳育種實踐基地(江西省南昌市南昌縣武陽鎮)。

從同時期飼養的200羽籠養寧都黃公雞中隨機選取10羽，在室外解剖，用滅菌的細線扎住嗉嚢以上和結腸兩個部位，將消化道取出放入裝有75%乙醇的燒杯，再轉移入超凈工作臺中，無菌采集盲腸內容物。將10個盲腸內容物樣品各取相等濕重，混合均勻，放入-70 ℃冰箱中備用。

試驗選用試劑盒包括：QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit(QIAGEN)，Stool gDNA Miniprep Kit(BIOMIGA)，糞便基因組DNA快速提取試劑盒(BioTeke)。

1.2 方 法

1.2.1 不同試劑盒提取效果比較 取寧都黃雞盲腸內容物混合樣品150 mg，分別使用QIAGEN、BioTeke、BIOMIGA 3個公司的試劑盒提取基因組DNA，每種試劑盒重復提取3份。QIAGEN公司試劑盒提取產物標記為Qia，BioTeke公司試劑盒提取產物標記為Ke，BIOMIGA公司試劑盒提取產物標記為GA。將提取的基因組DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并置于-20 ℃保存備用。

以上述提取的基因組DNA為模板，以細菌16S rDNA擴增引物N8(5'-AGAGTTTGATGGCTCAG-3')和N1487(5'-ACGGTTACCTTGACGACTT-3')進行PCR 擴增。采用25 μL擴增體系：上、下游引物各1 μL，12.5 μL Taq green mix(2×)，0.5 μL的樣品DNA模板和10 μL的dd H2O。PCR反應條件為94 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

1.2.2 擴增子測序及分析 以上述3種試劑盒提取的基因組DNA為模板，使用16S rDNA V3-V4區特異引物341F(5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3')和806R(5'-GCACTACHVGGGTWTCTAAT-3')進行PCR擴增，擴增程序：98 ℃變性1 min，擴增30個循環(98 ℃ 10 sec；50 ℃ 30 sec；72 ℃ 30 sec)，72 ℃延伸5 min。PCR產物使用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，對目的條帶使用Thermo Scientific公司的GeneJET膠回收試劑盒回收純化。采用TruSeq○RDNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用HiSeq2500平臺進行測序。原始數據去除Barcode和引物序列后經拼接、過濾、去除嵌合體后得到有效數據。再對有效數據在97%水平上用UPARSE軟件進行操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)聚類，并進行物種注釋。使用QIIME軟件進行Alpha多樣性和Beta多樣性分析。以上試驗由北京諾禾致源生物信息有限公司協助完成。

1.2.3 LEfSe分析組間差異菌 使用LEfSe軟件進行LDA Effect Size檢測，將對數線性判別分析(LDA，Linear discriminative analysis)評分閾值設為4，Kruskal-Wallis秩和統計檢驗分析獲得組間具有統計學差異的生物標識。

1.2.4 數據統計分析 采用SPSS 19.0統計分析軟件對試驗數據進行處理，非參數Kruskal-Wallis秩和統計進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同試劑盒基因組DNA提取效果比較

2.1.1 3種試劑盒提取樣本的瓊脂糖凝膠電泳 如圖1所示，BioTeke公司的試劑盒提取樣本的基因組DNA條帶稍暗，但較清晰、整齊；BIOMIGA公司的試劑盒提取的樣本條帶與QIAGEN公司試劑盒提取的樣本條帶差別不明顯。雖三種試劑盒基因組DNA的提取效果有區別，但無法清晰對比出三者之間的優劣。

圖1 3種試劑盒提取基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖M.Marke Q；1～2.QIAGEN試劑盒；3～4.BioTeke試劑盒；5～6.BIOMIGA試劑盒Fig.1 Agarose gel electrophoresis image of genomic DNAextracted by 3 different kinds of kitsM. Marke Q; 1～2. QIAGEN kit；3～4. BioTeke kit;5～6. BIOMIGA kit

2.1.2 3種試劑盒提取基因組DNA樣本的PCR擴增效果比較 如圖2所示，QIAGEN、BioTeke、BIOMIGA 3個公司的試劑盒所提取的基因組DNA都能成功擴增出16S rDNA產物，且擴增出的條帶都清晰處于同一水平。

2.1.3 擴增子測序序列數和OTU數量統計 對GA、Ke、Qia 3組樣品分別進行16S rDNA V3-V4區擴增子測序分析。如表1所示，各組樣品經過濾嵌合體后，有效數據均不低于6×104條。雖然樣本Qia組有效數據均值最高，Ke組有效數據均值最低；而OTU聚類結果則為GA組均值最高，Qia組均值最低。但根據Kruskal-Wallis秩和檢驗結果顯示，各組數據差異不顯著(P>0.05)。對3組樣本進行均一化處理，后續的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數據(均一化時選取的數據量：cutoff=32158)。

圖2 不同試劑盒提取基因組DNA的16S rDNA PCR擴增產物圖M.Marke Q；1～2.QIAGEN試劑盒；3～4.BioTeke試劑盒；5～6.BIOMIGA試劑盒Fig.2 16S rDNA PCR amplification products of genomicDNA extracted from different kitsM. Marke Q; 1～2. QIAGEN kit;3～4. BioTeke kit; 5～6. BIOMIGA kit

表1 樣品序列數和OTU數量統計Table 1 Statistics of sample sequence number and OTU quantity

2.1.4 Alpha多樣性比較 如圖3所示，各組樣品隨機抽取的數據量達到30 000以上時，曲線趨于平坦，說明所得序列可基本反映真實環境中細菌群落結果[10]。采用Shannon、Simpson、Chao1、ACE等指數來表征各組樣品中微生物的Alpha多樣性，如表2所示。對各組間Alpha多樣性指數值進行Kruskal-Wallis秩和檢驗，結果表明，各組間Chao1、ACE指數值均無顯著差異，但Ke-GA和Qia-GA兩組間Shannon指數和Simpson指數差異顯著，而Qia-Ke間無顯著差異(見表3)。說明BioTeke公司和QIAGEN公司提取樣本的群落多樣性較為接近，BIOMIGA公司提取樣本的群落多樣性與前兩者差異顯著。

表2 各組樣品間Alpha多樣性統計Table 2 Alpha diversity statistics of different groups

表3 各組樣品間Alpha多樣性統計差異顯著性檢測結果Table 3 Difference significance test results of Shannonindex between different groups

圖3 各組樣品稀釋曲線Fig.3 Rarefaction curve of each group

2.1.5 物種分布情況分析 選取3組樣品在門、綱、目、科或屬分類水平上平均豐度排名前10的物種，生成三元相圖(ternaryplot)，可以直觀查看3組樣本在各級分類水平上優勢物種的差異[11]。從圖4可以看出，3組樣品在各級分類水平上優勢物種均有不同。引起差異的原因推測是試劑盒種類不同，對各微生物類群的裂解效率不同。

2.1.6 Beta多樣性分析 Beta多樣性組間差異分析的箱形圖見圖5，Kruskal-Wallis秩和檢驗結果表明，各組間物種Beta多樣性差異不顯著(P>0.05)。進一步通過MRPP分析進行組間群落結構差異顯著性檢驗，Observe Delta值越小說明組內差異小，Expect delta值越大說明組間差異大；A值大于0說明組間差異大于組內差異，A值小于0說明組內差異大于組間差異。由表4可知，3種試劑盒提取物分析獲得的盲腸微生物群落結構具有組間差異，但差異不顯著(P>0.05)。

2.1.7 組間差異菌分析 用LDA值作分布柱狀圖和進化分支圖(圖6)。柱狀圖的長度揭示差異菌群影響的大小。進化分支圖由內至外輻射的圓圈代表由門至屬(或種)的分類級別，每個小圓圈代表該水平下的一個分類，其直徑大小與相對豐度大小呈正比；無顯著差異的統一著色為黃色，差異生物標識跟隨組進行著色。通過LEfSe算法進行的組間微生物差異分析結果表明，LDA為4時，組間具有統計學差異(P<0.05)的生物標識有5個，均與Qia組相關，生物標識影響由大至小分別為擬桿菌門(Bacteroidetes)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、擬桿菌目(Bacte-roidales)、理研菌科RC9腸菌群(Rikenellaceae RC9 gut group)、理研菌科(Rikenellaceae)。

圖4 各級分類水平三元相圖Fig.4 Ternaryplot under each classification levels

圖5 Beta多樣性箱形圖A. Weighted Unifrac；B. Unweighted UnifracFig.5 Box-plot of Beta diversity

表4 MRPP 組間差異分析Table 4 Difference analysis between MRPP groups

圖6 組間微生物差異效應判別分析柱狀圖(A)和進化分支圖(B)Fig.6 Histogram(A) and cladogram(B) based LEfSe analysis of different groups

2.2 寧都黃雞腸道菌群組成分析

綜合3種試劑盒提取物的擴增子分析結果，獲得寧都黃雞盲腸微生物在各級分類水平上的菌群組成特征。

2.2.1 門水平下盲腸菌群組成分析 寧都黃雞腸道微生物群落構成多樣性豐富。將3組樣本注釋到門水平，共檢測到21個菌門，其中18個門在3組樣本中均可檢出，而芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和纖維桿菌門(Fibrobacteres)只在GA組中檢出，黏膠球形菌門(Lentisphaerae)只在Ke和Qia組中被檢出，且這3個菌門占比均不足0.01%。相對豐度前10的菌門見圖7，結果表明寧都黃雞盲腸菌群以擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、廣古菌門(Euryarchaeota)和變形菌門(Proteobacteria)4個菌門為主，占比達90%以上。

2.2.2 綱水平下盲腸菌群組成分析 在綱的分類水平共鑒定出50個綱，相對豐度前10的菌綱見圖8。其中擬桿菌綱(Bacteroidia)、甲烷桿菌綱(Methanobacteria)和梭狀芽胞桿菌綱(Clostridia)是相對豐度最高的3個綱，占比超過75%。相對豐度前10的菌綱占比已達總菌的90%以上。

圖7 基于門水平菌群分布Fig.7 Distribution of intestinal microflora at phylum level

圖8 基于綱水平菌群分布Fig.8 Distribution of intestinal microflora at class level

2.2.3 目水平下盲腸菌群組成分析 在目水平上，綜合3組樣本共鑒定出80個目，相對豐度前10的菌目見圖9。其中擬桿菌目(Bacteroidales)、甲烷桿菌目(Methanobacteriales)和梭狀芽胞桿菌目(Clostridiales)總比例已超過75%。

2.2.4 科水平下盲腸菌群組成分析 將3組樣本注釋到科水平，共檢測到134個科。在注釋的寧都黃雞腸道微生物菌群中，甲烷桿菌科(Methanobacteriaceae)是主要的優勢菌群；相對豐度排名前十的還有理研菌科(Rikenellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、線粒體科(Mitochondria)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)、肉桿菌科(Carnobacteriaceae)、Bacteroidales S24-7 group、脫硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)。

圖9 基于目水平菌群分布Fig.9 Distribution of intestinal microflora at order level

2.2.5 屬水平下盲腸菌群組成分析 對3組樣本注釋到屬水平，共鑒定出268個菌屬。從圖11可知，相對豐度較高的前3個屬分別是甲烷桿菌屬(Methanobrevibacter)、理研菌科RC9腸菌群(RikenellaceaeRC9gutgroup)和擬桿菌屬(Bacteroides)。

圖10 基于科水平菌群分布Fig.10 Distribution of intestinal microflora at family level

圖11 基于屬水平菌群分布Fig.11 Distribution of intestinal microflora at genus level

3 討 論

3.1 不同試劑盒提取基因組DNA效果比較

通過擴增子測序分析，雖然不同試劑盒提取的基因組DNA分析所得組間群落結構確有差異，但使用BIOMIGA、BioTeke和QIAGEN的糞便基因組DNA提取試劑盒獲得的3組樣本間，群落結構差異不顯著。同時，代表物種豐富度的Chao1、ACE指數值在各組間也無顯著差異。但是，值得關注的是，兼有群落多樣性和均勻性因素的Shannon和Simpson指數值在Ke-GA和Qia-GA兩組間差異顯著，揭示菌群多樣性和均勻度分析結果差異顯著，即BIOMIGA公司試劑盒提取物分析所得菌群多樣性和均勻度與BioTeke及QIAGEN公司試劑盒提取物分析結果相比相對較低；而BioTeke及QIAGEN公司試劑盒提取物在腸道微生物物種豐富度分析中無顯著差異。提示不同試劑盒的微生物裂解效率差異可能對高通量測序分析結果產生影響。LEfSe分析結果顯示，LDA為4時，組間具有統計學差異的5個生物標識均與Qia組相關，且均屬于擬桿菌門，提示QIAGEN公司試劑盒在擬桿菌門微生物裂解效率方面具有明顯優勢。

3.2 寧都黃雞腸道菌群組成分析

迄今關于禽類不同物種腸道微生物組成的研究表明，盡管食性相同，但不同禽類腸道菌群依然存在部分分化的現象，說明宿主系統發生地位對腸道菌群結構起到了重要的作用[12-13]。雖然不同研究對雞同一腸段菌群組成特征分析結果不盡相同[14-20]，但擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)在雞腸道中，占比均較高，為主要優勢菌群。綜合3組樣本的結果，本研究在寧都黃雞盲腸內容物中共鑒定出21個門、50個綱、80個目、134個科、268個屬的微生物，物種豐富度高。雖然擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門相對豐度也較高，但與同類研究結果[21]不同的是，廣古菌門(Euryarchaeota)豐度顯著高于變形菌門；且在屬分類水平上，第一優勢屬為甲烷桿菌屬(Methanobrevibacter)，而已報道的雞盲腸優勢屬——梭狀芽孢桿菌(Clostridium)、瘤胃球菌(Ruminococcus)和乳桿菌(Lactobacillus)，在本研究中占比均相對較低。本研究中發現的菌群組成和物種分布差異是飼養環境或飼養條件引起的偶然現象，還是寧都黃雞腸道菌群的獨有特征，值得進一步驗證。

大量研究已經證明，腸道細菌可以為宿主提供養料，但也有一些腸道細菌與宿主競爭營養，因此分析腸道中的細菌類群對于闡明腸道菌群在促進宿主生長方面的作用機理以及為禽微生態制劑研究提供理論和實踐依據具有重要意義。本文充分發揮Illumina HiSeq測序方法的大數據優勢[22]，最大限度客觀還原腸道菌群結構以及豐度比例，為研究寧都黃雞腸道微生物與宿主之間的相互關系進一步優化寧都黃雞的飼養方式提供了前期基礎。