動物腸道中硫化氫的生理生態調控作用

胡佳昕,廖新俤

(華南農業大學 動物科學學院，廣東 廣州 510642)

數個世紀以來，來自下水道和化糞池的硫化氫(Hydrogen Sulfide,H2S)始終作為毒氣和環境污染物受到人們的關注。近年來越來越多的證據表明，H2S和NO、CO一樣，可以自由穿過生物膜并直接觸發細胞內的信號級聯反應，進而參與機體內的生理和病理過程，被認為是第三種氣體信號分子。過去對H2S的研究多集中于吸入H2S引起的全身性毒理生理反應，隨著對腸道微生態和各種腸道疾病機制的研究逐漸深入，腸道中H2S的生理學影響也成為了腸道研究中的重要一環。

1 H2S的理化性質及來源

1.1 H2S的理化性質

H2S是一種無色、易燃、有刺激性氣味的氣體，具有高度親脂性，能以自由擴散的方式通過脂質生物膜。H2S能溶于水，溶液呈弱酸性，存在如下平衡： H2S?H++HS-?2H++S2-(pKa1≈7.0，pKa2≈19)[1]。在動物體內，H2S主要以H2S和HS-形式存在，S2-的含量可忽略不計。H2S的存在形式與pH有關，生理條件(pH 7.4)下，約有70%的H2S以HS-形式存在；在呈堿性的線粒體基質(pH 8.0)中，HS-的含量可達92%；在酸性的溶酶體(pH 4.7)中，99%以上的H2S都以游離的形式存在[2]。在細胞中，HS-多以不穩定的鐵硫蛋白和相對穩定的有機硫化物形式存在，這些硫化物和游離H2S共同構成了被稱為活性硫物種(reactive sulfur species, RSS)的集合。

H2S中的硫對應的是它的最低氧化態。由于六價電子的存在，硫的氧化態可從-2到+6，這也是硫具有廣泛的生物學功能的原因。H2S是一種還原物，氧化還原電位約等于-280 mV(pH=7.0，相對于標準氫電極)，這與谷胱甘肽二硫化物/谷胱甘肽(GSSG/GSH)還原對接近。硫的這種廣泛生物學功能可能與硫在地球生命的出現和演化過程中的重要作用有關[3]。

1.2 體內H2S的來源

動物腸道組織中的H2S主要來自腸道上皮細胞和硫酸鹽還原菌(sulfate-reducing bacteria, SRB)的作用。

腸道上皮細胞主要通過胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase, CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase, CSE)兩種途徑分解L-半胱氨酸，合成H2S[4]。此外，3-巰基丙酮酸硫轉移酶(3-mercaptopyruvate sulfotransferase, MST)及蛋氨酸-γ-裂解酶(methionine gamma-lyase, MGL)對蛋氨酸及半胱氨酸裂解反應的催化亦能產生一定量的H2S。

SRB是一類能夠利用含硫氨基酸和硫酸鹽的嚴格厭氧菌，大多屬于δ-變形菌門，適宜生活于pH為5.5～8.5、溫度為24～42 ℃的環境，廣泛存在于哺乳動物的結腸中。在厭氧條件下，SRB通過一系列酶促反應利用含硫氨基酸和硫酸鹽，以H2為底物產生H2S，反應如下：4H2+SO42-+H+→HS-+4H2O[5]。有趣的事實是，SRB可能不僅影響腸道中的H2S濃度，也調節了體內其他組織和器官中硫的代謝：相較于無菌小鼠，常規小鼠在血漿、脂肪組織和肺組織中均具有更高水平的RSS，并且有著更高的CSE活性及更低的半胱氨酸水平[6]。

2 H2S對腸道的生理學影響

H2S在腸道中通過影響腸黏膜血流、刺激碳酸氫鹽及黏液分泌等方式參與腸道黏膜防御過程[7]，同時也以不同方式影響著腸道微生物區系。目前關于H2S對腸道的影響最令人信服的“鐘形曲線”理論提出：較低和較高濃度的H2S都對細胞具有不利影響，在某一區間內則表現為促進細胞增殖和維持腸道穩態的有利作用。

結腸內容物中的H2S濃度可高達0.2～3.4 mmol/L[8]。在這樣的濃度下，H2S很可能與來自食物的一些化合物如異硫氰酸酯、類黃酮或類胡蘿卜素等發生相互作用，并改變結腸上皮細胞對這些化合物的反應。高濃度的H2S也能夠嚴重抑制細胞色素C氧化酶，從而抑制線粒體氧消耗，造成細胞缺氧。H2S損害結腸細胞對丁酸鹽的利用，并且刺激上皮細胞增殖、增加腸上皮通透性。值得注意的是，結腸內容物中的硫化物并不總是以活潑的游離形式存在[9]。同時，結腸上皮細胞中廣泛表達的硫醌氧化還原酶(sulfide-quinone reductase, SQR)能夠強有力地將硫化物氧化成硫代硫酸鹽，這一機制保護了消化道及其他組織免受局部高H2S濃度的潛在不利影響[10]。

腸腔中H2S的濃度主要取決于飲食(十字花科植物、大蒜及發酵魚類均可提供高含量的硫化物)和SRB豐度，不同種類的動物之間存在一定的差異。本實驗室陸東東等研究發現，不同品種蛋雞盲腸內容物體外發酵液中SO42-變化量及H2S排放量均存在差異，其中杏花雞顯著低于其他品種蛋雞[11]；而鄧遠帆等在杜×長×大三元雜商品豬中開展的研究則表明，添加菊粉、低聚果糖和低聚半乳糖一方面可作為碳水化合物的補充，減少含硫蛋白類物質酵解，從而減少該途徑下H2S的生成；飼喂1%菊粉日糧45 d后，豬腸道內SRB生長受到抑制，擬桿菌門細菌比例增加；同時減少了L-氧化半胱氨酸和丙酮酸途徑的H2S生成[12]。

2.1 結直腸癌

結直腸癌(Colorectal Cancer, CRC)是全球范圍內最常見的消化道癌癥之一，在全球每年有超過60×104人直接或間接死于CRC。CRC與腸道微生物代謝產物間可能存在關聯：在抑制DNA修復功能的HT29-Cl.16E結腸細胞系中觀察到NaHS(20 μmol/L)能夠濃度依賴性地導致染色體不穩定(chromosomal instability, CIN)，而CIN存在于高達80%的CRC中，與癌細胞的進化和轉移密切相關[13]。同時，亦有報導同樣濃度的NaHS能通過上調Akt和ERK磷酸化、減少p21(Waf1/Cip1)表達和NO合成促進另一種結腸癌細胞系HCT116細胞的增殖[14]。

另一方面，發現NaHS(100 μmol/L)處理誘導了細胞外信號調節激酶(ERK)和p38 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化，抑制細胞活力。值得注意的是，抑制p38 MAPK活化進一步加強了NaHS對細胞活力的抑制作用[15]。同樣在HCT116細胞上，發現抑制內源H2S合成酶活性或提供線粒體靶向的H2S供體AP39(60 μmol/L)能夠抑制細胞增殖[16]。H2S對CRC細胞的作用符合“鐘形曲線”假說：靜止期結腸癌細胞位于曲線頂點右側，隨著H2S供體濃度增加細胞增殖受到抑制[17]。

2.2 炎癥性腸病

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)包括結腸和小腸的一系列炎性癥狀，主要包括克羅恩病(Crohn's disease, CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)。IBD期間存在典型的腸道微生態失調，具體可表現為屬于厚壁菌門的保護性細菌如乳酸桿菌屬及雙歧桿菌屬的減少，而變形菌門、放線菌門和擬桿菌屬增加[18]。此外，活動期和非活動期患者之間也存在不同的生態失調，表明腸道菌群的改變與腸道的炎癥環境有關[19]。

在潰瘍性結腸炎發作期間，腸腔內具有較高的H2S濃度和SRB豐度，并且與結腸炎的嚴重程度呈正相關，尤其是D.desulfuricans和D.vulgaris的含量[20]。結腸炎期間的腸上皮屏障缺陷加重了SRB對腸黏膜的侵襲，激活腸上皮細胞和免疫細胞中的Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)進而造成腸道穩態失衡和炎癥[21]。Pitcher等[22]研究證實，在活動性UC患者中分離的SRB能導致腸腔內更高水平的H2S，表明SRB對腸道炎癥的影響可能建立在H2S的增加上。利用三硝基苯磺酸誘導的結腸炎離體結腸段模型中發現，厭氧菌對腸道炎癥的發展起關鍵作用[23]。此外，SRB對廣譜抗生素的耐藥性可能與抗生素導致的腹瀉及腸道炎癥有關[24]，利用5-氨基水楊酸治療活動性潰瘍性結腸炎時，觀察到降低的SRB活性[25]。

減少飲食中含硫氨基酸的含量似乎對結腸炎有益。最近一項關于小兒克羅恩病的研究顯示，H2S在線粒體氧化功能受損的患者中加重了炎癥表現，這些患者同時也表現有SRB豐度的升高[25]。在由非甾體抗炎藥(Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs，NSAIDs)誘導腸道潰瘍的小鼠中也觀察到了類似的SRB增加[26]，而用質子泵抑制劑奧美拉唑和蘭索拉唑治療潰瘍時觀察到γ變形菌綱的豐度增加[27]。

盡管如此，SRB和H2S對腸道炎癥的影響機制尚待探討。結腸上皮細胞能利用H2S作為細胞呼吸的燃料[28]，一項通過直腸活檢和實時PCR鑒定并定量脫硫弧菌屬的研究顯示，UC患者和健康人群間不存在疾病相關差異[29]，也沒有發現IBD患者中細胞代謝硫化物的硫氰酸酶等的下調[30]。大約50%的大蒜素在模擬條件下能轉化為H2S[31]，在一項研究中，一日兩次給予小鼠60 mmol/kg的大蒜素(diallyl disulfide, DADS)5 d，沒有發現任何組織或形態學上的改變或黏膜炎癥反應[32]。此外，結腸組織產生的內源性H2S對黏膜具有一定的保護作用。在通過三硝基苯磺酸誘導的結腸炎大鼠模型中發現H2S的內源合成在誘導結腸炎后的首日顯著上調并隨著結腸炎的發展下降至正常水平[33]，提示H2S在抑制結腸炎中的潛在作用。美沙拉嗪衍生物ATB-429能夠釋放H2S，可減少結腸炎相關的白細胞浸潤及促炎因子的表達[34]。

2.3 H2S對腸道的積極影響

腸道健康建立于腸道微生物組生態平衡及腸黏膜的正常生理功能之上，最近的一些研究發現H2S或能通過調控腸道微生態平衡來降低腸黏膜對損傷的敏感性[7]。腸道微生態失衡與腸道黏膜防御受損有關，而H2S在胃腸道黏膜防御中的重要作用為開發保護胃腸道、加速胃腸道損傷恢復及減輕NSAIDs所誘導的胃腸道炎癥的藥物提供了思路[35]。

H2S在酒精、NSAIDs和缺血后再灌注所誘發的胃腸道損傷中表現出保護作用，同時能夠促進炎癥消退及組織修復[36-38]。有研究發現在幾種動物模型中H2S供體都能促進結腸炎的消退[33,39]。能夠釋放H2S的NSAIDs衍生物如ATB-346可減少萘普生對腸道的損傷[40]，其原因可能是降低了膽汁酸的細胞毒性[41]。此外，H2S有助于維持腸道微生物所構成的生物膜。給予H2S供體可加速結腸炎大鼠生物膜恢復并減少細菌移位，體外試驗中也發現H2S供體可促進生物膜代謝活性和生物量增加[7]。H2S供體大蒜素也已被發現對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌都具有抑制作用[42]。

H2S可以通過多種方式影響腸道微生物群落與腸道上皮細胞之間的關系，可以明確的是，H2S在維持腸道微生物生態平衡中起重要作用。在病理狀態下，利用H2S的生理生態調控作用來減少和修復腸損傷可能是一個重要的研究方向。

3 總結與展望

H2S在動物體中具有廣泛的生理學影響。由于飲食中的硫化物被腸道中定植的SRB還原利用，腸腔中的H2S濃度遠高于機體內其他組織或器官，H2S也通過多種方式參與腸道內環境穩態的調節。在一定濃度下，H2S利于腸道黏膜層構建、促進腸道微生態恢復；另一方面，毫摩爾濃度的H2S被認為能通過阻抑丁酸鹽的氧化過程進而破壞腸道上皮屏障，參與結腸癌期間的細胞周期失調并保護結腸癌細胞免受凋亡誘導劑影響。可以說，能夠直接接觸腸上皮細胞的H2S濃度是關系到H2S治療窗界限的重要因素。在現代畜禽生產中，腸腔中H2S濃度主要取決于飼料中所提供的硫化物和腸道微生物的代謝，而腸道微生物受到多種因素的共同影響。

但是，生理環境中游離H2S的濃度仍是一個尚未明確的難題。有報道稱H2S在哺乳動物組織中的含量在50～160 μmol/L之間[43]，即使僅限于腸道中，H2S的濃度也存在巨大的差異：在盲腸和直腸中可能只有約40 μmol/L[44]，而在結腸可能高達250 μmol/L[45]。隨著檢測方法的改進，H2S在體內的報道濃度存在變低的趨勢，但仍未有一種方法能準確地測定體內的H2S濃度，更多地則是用RSS或硫化物含量作為衡量指標。這種不確定性一方面與不同檢測方法靈敏度及可靠性有關，另一方面則提示著H2S在體內廣泛參加的多種生化反應中可能以多種形態存在，并具有復雜的代謝動力學。但可以明確的是，游離H2S和其他硫化物在體內共同作用于機體，后者在一定條件下，存在按需釋放H2S的可能性。現有報道中，H2S促進細胞增殖和產生細胞毒性的濃度依使用的H2S供體及細胞系不同而不同。有證據表明，在同一腸細胞系中，利用NaHS等快速釋放供體與AP39等緩釋型供體時H2S分別表現為毒性和促生長兩種截然不同的作用結果。此外有報道稱，腸上皮屏障即使暴露于高濃度硫化物仍可保持完整，提示正常情況下腸道能夠應對腸腔中高達毫摩爾濃度的H2S；相反地，SRB所產生的硫化物能夠使粘蛋白變性，進而將黏液層變得薄且易于被細菌滲透，引發炎癥反應。

在H2S的細胞毒性方面，有報道H2S通過與細胞色素氧化酶C中的鐵結合使得線粒體呼吸鏈受阻，造成細胞缺氧[46]；同時H2S又對線粒體具有一定的保護作用。考慮到結腸上皮細胞以高耗氧為特征的代謝，線粒體對H2S的利用可能是進一步探究H2S對腸道細胞影響機理的切入點。此外，H2S對細胞作用的靶點仍未被確認。盡管已經有豐富研究表明，H2S影響KATP及其他離子通道[47]，但在不同細胞中似乎存在不同的靶點。H2S對cGMP和cAMP的作用也不能明確。有報道稱NaHS不能影響兩者的水平[48]，也有報道稱H2S通過非競爭性抑制磷酸二脂酶活性提高了cGMP和cAMP水平[49]。可以明確的是，H2S通過與目標蛋白的金屬中心反應導致蛋白結構和功能的改變。并且，H2S與NO、CO之間的相互作用可能也是H2S復雜作用機理的原因之一。

鑒于H2S對腸道的復雜影響，確定H2S的治療窗將成為利用H2S影響腸道健康的重要一步。為此，需要建立更為靈敏和可靠的檢測方法，以及確定不同H2S供體(最常見的快速釋放型供體是NaHS，此外還有緩釋型供體如GYY4137、AP39等)對細胞、組織和腸道的影響。在機理方面，明確H2S對腸道上皮細胞的作用靶點及其作為氧傳感器的作用機制或能解釋結腸上皮細胞對H2S的解毒作用和高濃度H2S的毒性作用。整合生理學和毒理學的兩方面，進一步研究H2S對腸道的影響有助于對腸道內穩態的認識，并為腸道健康的維持提供新的思路和切入點。