異甘草素聯合順鉑抑制三陰性乳腺癌細胞增殖的效果研究

梅瑜 張松 蔣靜

乳腺癌是女性常見的癌癥之一，是全球第五大癌癥死亡原因[1-2]。在眾多乳腺癌亞型中，三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）由于癌細胞增殖、侵襲轉移能力強，是目前最難治療的乳腺癌亞型[3]。盡管現在有以聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）抑制劑為典型代表的多種小分子抑制劑被證明治療TNBC效果顯著[4-5]，但小分子抑制劑普遍存在適應證范圍狹窄、易產生耐藥的問題[5-6]，目前臨床上用于治療TNBC的藥物主要還是紫杉醇和順鉑（cisplatin,DDP）等化療藥物[7]。然而，TNBC患者容易對化療藥物產生耐藥性，表現為臨床預后差、易復發[7-8]。DDP主要通過引起DNA損傷來誘導細胞死亡[9-10]。癌細胞長期暴露于DDP下可導致細胞內參與DNA損傷修復的一些基因的過度表達和活化，導致DNA修復功能增強而產生耐藥性[11-12]。

異甘草素（isoliquiritigenin,ISL）是從甘草中提取出來的，具有抗腫瘤活性成分，被證明可通過誘導細胞凋亡、促進細胞自噬、抑制癌組織血管生成等多種機制治療乳腺癌[13-14]。同時有研究表明，ISL可導致其下游骨髓細胞瘤癌基因（c-Myc）的過度表達[15]。而c-Myc的異常表達被證明可上調重組酶51（Rad51）、乳腺癌易感基因（BRCA）1/2的表達，繼而促進DNA同源重組（HR）修復[16-17]。因此本研究旨在探究ISL聯合DDP抑制TNBC細胞增殖的效果，并初步探討兩者協同治療TNBC的機制。

1 材料和方法

1.1 細胞株 人野生型TNBC細胞株MDA-MB-231購自上海生命科學院細胞資源中心。

1.2 主要試劑與儀器 c-Myc一抗（批號：18583S）、Rad51一抗（批號：8875S）、BRCA1 一抗（批號：14823S）、BRCA2 一抗（批號：10741S）、β-肌動蛋白（β-actin）一抗（批號：4970S）、鼠二抗（批號：14709S）和兔二抗（批號：14708S）均購自美國Cell Signaling Technology公司；DDP（批號：P4394，規格：25 mg）和 ISL（批號：I3766，規格：10 mg）均購自美國Sigma-Aldrich公司；MTT細胞生長活力檢測試劑盒（批號：KGA311）、Annexin VFITC和典化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒（批號：KGA105）、彗星實驗測試試劑盒（批號：KGA240）、Leibovitz's L-15培養基（批號：KGM41300-500）和胰酶（批號：KGY001）均購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；RIPA細胞裂解緩沖液（批號：SY021-100）購自南京三翊生物科技有限公司；Cytation 5酶標儀購自美國Biotek公司；FACSCantoⅡ流式細胞儀購自美國BD公司；EVOS XL Core倒置熒光顯微鏡購自美國 ThermoFisher公司；Gel DocTMXR+凝膠成像系統購自美國Bio-rad公司；CO2細胞培養箱購自美國ThermoFisher公司；蛋白電泳儀系統購自美國Bio-rad公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 人野生型TNBC細胞株MDA-MB-231置于含10%FBS、100 mg/L鏈霉素、100 KU/L青霉素的Leibovitz's L-15培養基中培養。細胞培養箱條件：CO2濃度為5%，溫度為37°C。

1.3.2 細胞分組及細胞活力測定 采用MTT法。將對數生長期的MDA-MB-231細胞隨機分為4組：ISL/DDP 聯用組（同時經 10 μmol/L ISL 和 10 μmol/L DDP共同處理MDA-MB-231細胞48 h）、DDP處理組（經30 μmol/L DDP 處理 MDA-MB-231細胞 48 h）、ISL 處理組（經25 μmol/L ISL處理 MDA-MB-231細胞48 h）和對照組（未施藥的MDA-MB-231細胞）。將各組細胞以5×104個/ml接種于96孔板，培養過夜。待細胞貼壁之后，給各組細胞施藥48 h，隨后加入MTT繼續培養4 h，吸除上清液，在每孔加入150 μl DMSO，震蕩 30 s之后，用酶標儀測定570 nm處的吸光度值。細胞活力=實驗組吸光度值/對照組吸光度值×100%。半數抑制濃度（IC50）值為抑制細胞活力到50%的藥物濃度。

1.3.3 ISL/DDP聯用組協同指數（CI）測定 參考ISL處理組和DDP處理組對應藥物的IC50值，ISL/DDP聯用組 ISL 與 DDP 聯用比例設置為 4∶1、2∶1、1∶1、1∶2 以及 1∶4。公式 CI=CA,X/ICX,A+CB,X/ICX,B[18]。其中 CA,X和 CB,X分別表示ISL和DDP聯合用藥達到X%生長抑制率的濃度。而ICX,A和ICX,B則表示ISL和DDP單獨使用達到相同生長抑制率時的濃度。當CI＜1時表明兩者聯用具有協同效果，CI=1時表明兩者沒有協同作用僅僅是加和作用，當CI＞1時表明兩者聯用具有拮抗作用。

1.3.4 4組細胞凋亡率檢測 采用Annexin V-FITC和PI雙染法。將對數生長期的MDA-MB-231細胞以2×105個/ml接種在6孔板上。將4組處理后的細胞用不含EDTA的胰酶消化，PBS清洗兩遍，按照試劑盒說明書方法分別用Annexin V-FITC和PI對各組細胞染色。采用流式細胞儀測定各組細胞凋亡情況，以Annexin V陽性的凋亡細胞比例作為凋亡率進行統計，細胞凋亡數據采用FlowJo 7.6軟件處理。

1.3.5 4組細胞DNA損傷程度檢測 采用彗星實驗法[19]。將對數生長期的MDA-MB-231細胞以2×105個/ml接種在6孔板上。將4組處理后的細胞用不含EDTA的胰酶消化，并用不含Ca2+的PBS清洗兩遍。取1×104個/ml的細胞與低熔點瓊脂糖以1∶10混合并鋪在載玻片上。隨后用試劑盒裂解緩沖液在4°C環境下裂解細胞2 h，后在室溫下用堿性解旋液解旋DNA 30 min。將解旋過DNA的細胞在21 V條件下電泳30 min，之后用PI染色，在倒置熒光顯微鏡下觀察。每個載玻片隨機選擇5個視野進行觀察。

1.3.6 4 組細胞 c-Myc、Rad51、BRCA1、BRCA2 表達水平檢測 采用Western blot法。收集各組處理后的細胞，用RIPA細胞裂解緩沖液在冰上裂解細胞60 min。取各組25.0 μg全蛋白用SDS-PAGE凝膠電泳分離，并將分離得到的目標蛋白通過濕法電轉印到PVDF膜上。膜上的蛋白用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，之后用一抗4°C孵育過夜，二抗室溫孵育1 h。最后，PVDF膜上的蛋白用增強化學發光液顯色，檢測系統檢測后，用Image J處理并比較各組蛋白表達水平的差異。本研究實驗室部分工作委托南京三翊生物科技有限公司完成。

2 結果

2.1 DDP處理組和ISL處理組細胞活力的比較 DDP處理組中，隨著DDP濃度的增加，細胞活力顯著降低，對應的 IC50值為（29.8±2.3）μmol/L；ISL 處理組中，隨著ISL濃度的增加，細胞活力逐漸降低，對應的IC50值為（25.6±1.8）μmol/L。見圖 1。

圖1 順鉑（DDP）處理組和異甘草素（ISL）處理組細胞生長活力的比較

2.2 ISL/DDP聯用組不同濃度比例時的CI比較 ISL/DDP 聯用組內，當 ISL/DDP 聯用濃度比例為 1∶2、1∶1 以及2∶1時，對應的CI均＜1.0。當ISL/DDP聯用濃度比例為1∶1時，兩者抑制細胞活力到50%的CI值為0.84，協同效果最好。見圖2。

圖2 異甘草素（ISL）/順鉑（DDP）聯用組不同濃度比例時的協同指數（CI）比較

2.3 4組細胞凋亡率比較 與對照組比較，DDP處理組和ISL處理組細胞凋亡率均明顯增加，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與DDP處理組比較，ISL/DDP聯用組細胞凋亡率明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 3、表 1。

表1 4組細胞凋亡率比較（%）

圖3 4組細胞凋亡率比較（ISL為異甘草素；DDD為順鉑）

2.4 4組細胞DNA損傷程度比較 與對照組比較，DDP處理組和ISL處理組細胞內均可見明顯的DNA拖尾，DNA損傷程度顯著；與ISL處理組比較，ISL/DDP聯用組DNA拖尾現象更加明顯；與DDP處理組比較，ISL/DDP聯用組DNA拖尾現象無明顯變化。見圖4。

圖4 4組細胞DNA損傷程度比較（DDD為順鉑；ISL為異甘草素）

2.5 4組細胞 c-Myc、Rad51、BRCA1及 BRCA2表達水平比較 與對照組比較，DDP處理組Rad51和BRCA1表達水平均明顯增加，差異均有統計學意義（均P＜0.05），ISL處理組 c-Myc、Rad51、BRCA1以及 BRCA2表達水平均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與DDP 處理組比較，ISL/DDP 聯用組 c-Myc、Rad51、BRCA1以及BRCA2表達水平均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與ISL處理組比較，ISL/DDP聯用組c-Myc、Rad51及BRCA2表達水平均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見圖5、表2。

表2 4組細胞c-Myc、Rad51、BRCA1及BRCA2表達水平比較

圖5 4組細胞骨髓細胞瘤癌基因（c-Myc）、重組酶51（Rad51）、乳腺癌易感基因1（BRCA1）及乳腺癌易感基因2（BRCA2）表達的電泳圖（DDD為順鉑；ISL為異甘草素；β-actin為β-肌動蛋白）

3 討論

TNBC細胞增殖、侵襲轉移能力強，無法通過內分泌及抗人表皮生長因子受體-2分子進行靶向治療，因此是致死率很高的乳腺癌亞型[1-3]。盡管有很多小分子抑制劑相繼研發用于靶向治療TNBC，但由于抑制劑本身適應證范圍狹窄，目前DDP和紫衫醇依舊是治療TNBC的臨床主要用藥[4-7]。與紫杉醇治療機制不同，DDP主要是通過與癌細胞DNA作用致DNA損傷，最終導致細胞死亡[9-10]。與所有的化療藥物相同，腫瘤細胞對DDP會產生適應性耐藥[11-12]。耐藥細胞對DDP不再敏感，這限制了藥物的臨床使用。目前，針對單一藥物耐藥性問題，臨床主要通過聯合用藥來提高腫瘤治療效果。

ISL作為甘草提取物，其主要的抗腫瘤成分被證明可通過多種途徑抑制乳腺癌細胞惡性增殖。本研究發現ISL和DDP都可以很好地抑制野生型TNBC細胞MDA-MB-231的惡性增殖。通過雙藥協同實驗，本研究亦發現ISL和DDP聯用可以協同抑制細胞活力。隨后，本研究分析了兩者聯用抑制MDA-MB-231細胞惡性增殖的原因，發現ISL和DDP聯用不僅可以協同誘導細胞凋亡，還可以促進DNA損傷。

細胞內DNA活性氧物種或者化療藥物誘導損傷之后，細胞內一些參與DNA單鏈損傷修復及DNA雙鏈損傷修復的因子便會被激活并募集到損傷DNA處進行修復[20]。DDP主要通過誘導DNA損傷發揮抗癌功效[9-10]。但針對單一化療藥物，癌細胞可通過激活一些DNA損傷修復相關的因子來抵制藥物對本身的殺傷作用[12]。本研究發現，DDP在抑制細胞惡性增殖、誘導細胞凋亡和DNA損傷的同時，可以導致細胞內HR修復相關蛋白Rad51和BRCA1的過度表達。作為參與HR修復的主要蛋白，Rad51和BRCA1的過度表達將導致細胞HR修復功能增強[17]。這將導致細胞在長時間暴露于DDP之后，對其產生耐藥性。而ISL可以通過下調c-Myc的表達，進而下調其下游蛋白Rad51、BRCA1、BRCA2的表達來抑制HR修復。ISL和DDP聯用之后，細胞內c-Myc、Rad51、BRCA1以及BRCA2的表達量明顯降低。基于此，本研究團隊推斷ISL可通過阻遏損傷DNA的HR修復途徑，協同促進DDP引起的細胞DNA損傷和細胞凋亡，繼而抑制細胞的惡性增殖。

綜上所述，聯合ISL和DDP可以有效抑制TNBC細胞的惡性增殖。DDP可直接誘導TNBC細胞DNA損傷，ISL則可以通過下調HR修復相關蛋白Rad51、BRCA1及BRCA2的表達來阻遏損傷DNA的修復。兩者聯用可協同促進DNA損傷，誘導細胞凋亡。