硫化氫調控Nrf2-HO-1信號通路對休克大鼠肺損傷的保護作用

黃朝露 趙曉勇 林麗麗 徐文莉 李海燕

創傷失血性休克是機體遭遇重大創傷后死亡的主要原因之一[1]。創傷后的大出血、微循環灌注不足、組織廣泛損傷所導致的后續炎癥綜合征等均可引起重要臟器功能衰竭。而在后期復蘇時，缺血-再灌注損傷可進一步導致耗氧增加，氧化應激反應增強以及線粒體功能障礙[2]。因此如何減輕缺血-再灌注損傷，改善氧化應激和炎癥的發生至關重要。核轉錄因子E2相關因子2（Nrf2）是具有獨特cap-ncollar區域的轉錄因子，有研究表明，Nrf2可促進血紅素加氧酶-1（HO-1）的轉錄，對細胞有保護作用，在抗氧化應激過程中扮演重要角色[3]。硫化氫（H2S）是第3類氣體信號分子，在正常機體內可自行合成，參與機體各大系統生理、病理過程，有研究證實，H2S對創傷失血性休克具有保護作用[4-5]。本研究通過觀測外源性H2S硫氫化鈉（NaHS）對Nrf2/HO-1信號通路的作用，探討H2S對創傷失血性休克所致肺損傷的保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組 36只SD雄性大鼠由溫州醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SYXK（浙）2020-0014。大鼠置于自然光、安靜環境、室溫（23±2）℃、相對濕度（50±10）%環境下飼養 48 h以上，隨時可以進食、飲水。采用隨機數字表法分為NaHS處理組（NaHS組）、模型組（HTS組）和假手術組（Sham組），每組12只。

1.2 主要試劑和儀器 NaHS購自美國Sigma公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、髓過氧化物酶（MPO）測試盒均購自南京建成生物研究所；HE染色試劑盒購自北京Solarbio公司；Nrf2、HO-1和GAPDH抗體均購自美國Santa公司；山羊抗兔IgG（H+L）購自美國Abcam公司；醋酸鋅、N,N-二甲基-對苯二胺硫酸鹽、三氯醋酸、三氯化鐵均購自美國Sigma公司。OMRP24組織勻漿機購自北京鴻苑鑫儀科技有限公司；KDC-2046低速冷凍離心機購自安徽科大創新股份有限公司；Mini-Proten Tetra System成套電泳系統購自美國BIO-RAD公司；Multiskan GO全波長酶標儀購自美國Thermo Fish科技有限公司；RM2235輪轉式石蠟切片機購自上海徠卡顯微系統有限公司；LV-150N光學顯微鏡購自日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 模型的制備 動物模型的制備參照文獻[6]，所有大鼠禁食過夜，自由飲水，3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，作腹正中切口5 cm后縫合直接造成軟組織創傷。NaHS和HTS組大鼠一側股動脈留聚乙烯導管放血，另一側股靜脈插管輸液及股動脈插管連接壓力轉換器檢測平均動脈壓（MAP），在10 min內迅速放血使MAP維持在40 mmHg左右，此時為最大放血量；回輸40%最大放血容量的林格液維持上述低血壓狀態90 min，然后以4倍最大放血容量的林格液復蘇60 min，復蘇后立即縫合所有傷口。NaHS組在復蘇前腹腔注射0.5 ml NaHS（28 μmol/kg），HTS 組予等量 0.9%氯化鈉注射液。Sham組僅作腹部切口，不放血、不復蘇。復蘇2 h后麻醉大鼠，取動脈血2 ml，3 000 r/min離心10 min，提取上清液凍存備用；脫頸處死大鼠后迅速開胸，取雙肺組織備用。

1.3.2 血清H2S濃度及SOD、MDA、MPO水平測定 采用去蛋白方法測定H2S濃度，于血清中加入0.5 ml醋酸鋅形成沉淀，分別加入0.5 ml N，N-二甲基-對苯二胺硫酸鹽和三氯化鐵使之充分顯色，再加入0.5 ml三氯醋酸和2.5 ml蒸餾水使蛋白沉淀，5 000 r/min離心5 min后取上清液在665 nm波長處測吸光度值，根據標準曲線計算血清中H2S濃度。根據試劑盒說明書的具體步驟檢測血清SOD、MDA和MPO水平。

1.3.3 肺系數、肺濕/干重比檢測 肺組織稱重計算肺系數，肺系數=大鼠肺質量/大鼠體質量×100%。取左肺下葉稱濕重，置于75℃烤箱至恒重計算肺濕/干重比。

1.3.4 肺損傷形態觀察 將肺組織常規石蠟包埋，切片，HE染色，每組隨機選取3只大鼠各1張肺組織切片，每張切片隨機選取3個視野觀察大鼠肺組織的病理改變。

1.3.5 肺組織Nrf2、HO-1蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。在肺組織中加入適量RIPA蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，勻漿后提取蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉，孵育一抗并4℃過夜，TBST漂洗后孵育HRP結合的二抗，超敏ECL顯色，凝膠成像儀觀察并拍照。Image J測定光密度并分析。

2 結果

2.1 3組大鼠血清H2S濃度及SOD、MDA、MPO水平比較 與Sham組比較，HTS組H2S濃度及SOD、MDA、MPO水平差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與HTS組比較，NaHS組H2S濃度及SOD、MDA、MPO水平差異均有統計學意義（均P＜0.01）。見表1。

表1 3組大鼠血清H2S濃度、SOD、MDA、MPO水平比較

2.2 3組大鼠肺系數、肺濕/干重比比較 與Sham組比較，HTS組肺系數、肺濕/干重比均明顯增加，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與HTS組比較，NaHS組肺系數、肺濕/干重比均顯著下降，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。見表 2。

表2 3組大鼠肺系數、肺濕/干重比比較

2.3 3組大鼠肺損傷形態學比較 HE染色結果顯示，Sham組肺泡形態結構基本完整，輪廓清晰，未見病變；HTS組肺泡壁明顯增厚，水腫，炎性細胞浸潤，部分肺泡壁塌陷；而NaHS組大鼠肺泡水腫和炎性浸潤情況明顯改善。見圖1。

圖1 3組大鼠肺損傷形態學比較（HE染色，×200）

2.4 3組大鼠Nrf2、HO-1蛋白表達水平比較 與Sham組比較，HTS、NaHS組Nrf2、HO-1蛋白表達水平均明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與HTS組比較，NaHS組Nrf2、HO-1蛋白表達水平均明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。見圖2和表3。

表3 3組大鼠Nrf2、HO-1蛋白相對表達量

圖2 3組大鼠核轉錄因子E2相關因子2（Nrf2）、血紅素加氧酶-1（HO-1）蛋白表達的電泳圖（NaHS為硫氫化鈉）

3 討論

創傷失血性休克是由創傷所致機體有效循環容量急劇下降，最后發展為多器官功能障礙的連續過程，病理、生理過程包括機體灌注不足、組織器官缺血、缺氧、細胞代謝障礙、同時產生大量氧自由基等毒性因子使重要器官發生強烈的炎癥和氧化應激反應等。后期的液體復蘇在增加氧供的同時也造成了再灌注損傷，加劇了“氧供-氧耗”的失衡，氧化應激被進一步激活[1，7]。氧化應激是指體內氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態。正常機體內，氧自由基清除劑主要有SOD、POD和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）；MDA是氧自由基攻擊生物膜產生脂質過氧化反應的產物之一，因此可以通過檢測以上氧化應激指標來評價機體氧化應激損傷程度。

H2S作為繼一氧化氮和一氧化碳之后的第3種氣體分子，近些年越來越引人關注[8-9]，其主要通過提高細胞內的谷胱甘肽（GSH）水平來對抗氧化應激[10]。Geng等[11]首次提出H2S可通過抗氧化應激反應減輕心肌損傷；此外，H2S還可以通過絲裂原活化蛋白激酶信號通路減少活性氧（ROS）誘導的細胞凋亡[12]。本研究建立創傷失血性休克動物模型，觀察H2S供體NaHS對機體創傷早期引起氧化應激反應的影響。本實驗結果顯示NaHS組、HTS組肺組織中氧化應激標志物MDA、MPO水平均明顯高于Sham組，而NaHS組的MDA、MPO水平均明顯低于HTS組。此外，SOD水平檢測和HE染色結果進一步證明了H2S可在創傷失血性休克引起的肺氧化應激損傷中起到保護作用。

Nrf2（由Nfe2l2基因編碼）是主要的真核生物氧化還原活性因子，主要負責調節細胞氧化還原平衡、保護性抗氧化和Ⅱ期排毒反應，其中包括HO-1和SOD[3，13-14]。近期研究發現在肺缺血再灌注損傷小鼠中，經重組高遷移率族蛋白1（rHMGB1）預處理可通過Keap1/Nrf2/HO-1途徑抑制氧化應激，從而改善肺缺血再灌注損傷；且使用異丁香酚抑制該途徑會加重肺組織損傷和肺缺血再灌注損傷后的炎癥反應[15]。此外，Khan等[16]發現咖啡因可顯著降低ROS和脂質過氧化物水平，并增強Nrf2和HO-1的表達，從而改善鎘誘導的氧化應激、神經炎癥和認知障礙。研究還發現抗抑郁藥度洛西汀對氧化應激和細胞死亡的神經保護作用機制也依賴于Akt/Nrf2/HO-1途徑[17]。本實驗研究發現在SD大鼠創傷失血性休克發生后，大量炎性細胞浸潤，肺泡壁結構的破壞和增厚，肺系數和肺濕/干重比增加，而經外源性H2S干預后均可顯著改善。本研究中還發現創傷失血性休克可增加大鼠肺組織Nrf2和HO-1表達，說明Nrf2-HO-1信號通路可能參與了機體保護作用。干預后NaHS組Nrf2、HO-1表達進一步增加，說明H2S可能通過Nrf2-HO-1信號分子通路來維持“氧供-氧耗”的平衡，增強機體抗氧化應激能力，從而減輕創傷失血性休克導致的肺損傷。

綜上所述，外源性H2S可能通過激活Nrf2-HO-1信號通路抑制氧化應激反應，減輕炎性細胞浸潤和肺水腫，從而對創傷失血性休克大鼠產生肺保護作用。