超分支滾環(huán)擴(kuò)增法檢測(cè)美洲鰻鱺嗜水氣單胞菌

張世佳,馮建軍,郭松林,王藝?yán)?林 鵬

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021；2.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門(mén) 361021)

0 引言

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是一種人魚(yú)畜共患的病原菌，其存活范圍廣，能適應(yīng)多種復(fù)雜環(huán)境。該菌可致人、魚(yú)、畜感染，同時(shí)伴隨出血性敗血癥，嚴(yán)重可致死[1]。在魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖環(huán)境中也會(huì)引起細(xì)菌性敗血癥，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要有分離培養(yǎng)法和生理生化法[2]，但這些方法檢測(cè)周期較長(zhǎng)，不能滿足快速檢測(cè)的要求。免疫檢測(cè)法快速簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)，然而靈敏度不高[3]。分子檢測(cè)手段(如PCR法[4])特異性強(qiáng)、靈敏度高，但需要較為昂貴的變溫儀器，只適合在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

基于鎖式探針(padlock probe)[5]的超分支滾環(huán)擴(kuò)增(hyper-branched rolling circle amplification,HRCA)是一種恒溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)法。該方法的原理是，設(shè)計(jì)特異性的鎖式探針與一對(duì)通用引物，鎖式探針的兩端與目標(biāo)DNA通過(guò)互補(bǔ)連接成環(huán)，通用引物識(shí)別環(huán)狀鎖式探針，實(shí)現(xiàn)對(duì)鎖式探針的超分支滾環(huán)擴(kuò)增，從而達(dá)到信號(hào)放大的目的[6]。該技術(shù)依賴(lài)于探針，只有在兩端的捕捉序列與目標(biāo)DNA完全互補(bǔ)配對(duì)的前提下才能成環(huán)，因此檢測(cè)特異性強(qiáng)，已成功應(yīng)用于醫(yī)學(xué)[7]、食品[8]、農(nóng)業(yè)[9]等領(lǐng)域。HRCA由于是恒溫?cái)U(kuò)增，不需要昂貴的儀器，恒溫水浴鍋便可進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，并和紙基傳感器技術(shù)相結(jié)合[10]，可以直接讀取結(jié)果。本研究首次將HRCA法應(yīng)用于水產(chǎn)病原菌嗜水氣單胞菌的檢測(cè)，并在實(shí)際樣品的提取中應(yīng)用水煮法[11]，簡(jiǎn)化了處理步驟。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

嗜水氣單胞菌B11分離于病變鰻鱺，并經(jīng)Biolog自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)(GeneⅢ)鑒定為嗜水氣單胞菌[12]。特異性交叉實(shí)驗(yàn)所用菌株均來(lái)自西班牙普通微生保藏中心(CETC)。

1.1.2 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(GK4003-100)購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司;T4 DNA連接酶、Bst DNA 聚合酶、Exonuclease Ⅰ、Exonuclease Ⅲ、dNTPs源自美國(guó)Biolabs公司；鎖式探針和引物由上海生工生物工程公司合成。

1.1.3 主要儀器

HH·S21-4-S恒溫水浴鍋購(gòu)自上海坤誠(chéng)公司；GelDoc-It2 310凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)UVP公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 探針及引物設(shè)計(jì)

選取一段嗜水氣單胞菌獨(dú)有的AER基因序列(NC_008570)[13]，采用Primer Premier 5.0及Oligo軟件設(shè)計(jì)探針，探針兩端的捕捉序列與待檢目標(biāo)序列靶標(biāo)互補(bǔ)[14](見(jiàn)表1，鎖式探針中的大寫(xiě)字母序列)，探針中間的連接序列采用與嗜水氣單胞菌序列相差極大的野豬MSTN中的一段特異性序列作為連接序列和引物擴(kuò)增的結(jié)合序列(見(jiàn)表1，鎖式探針中的小寫(xiě)字母序列)。采用TheMFold(http://www.unafold.org/hybrid2.php)預(yù)測(cè)探針的結(jié)構(gòu)，以確保二級(jí)結(jié)構(gòu)能值最小，防止發(fā)夾結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，同時(shí)探針的5′端進(jìn)行磷酸化修飾，便于環(huán)化后探針3′和5′端的末端粘合。針對(duì)探針設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物P1和P2用于探針的擴(kuò)增。

表1 鎖式探針及引物

1.2.2 DNA提取

根據(jù)基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.3 連接反應(yīng)

10 μL的連接反應(yīng)體系:10×T4 DNA ligase buffer(50 mmol/L Tris-HCl、0.1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、50%甘油)1 μL，400 U/μL T4 DNA 連接酶1 μL，250 nmol/L探針1 μL、DNA模板2.5 μL、用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)至10 μL。體系在16 ℃下反應(yīng)1 h，然后65 ℃溫育20 min后停止反應(yīng)。

1.2.4 外切酶處理

連接反應(yīng)體系中還有許多雙鏈和單鏈DNA，會(huì)在擴(kuò)增的過(guò)程中產(chǎn)生背景信號(hào)，可能導(dǎo)致假陽(yáng)性的結(jié)果[15]，采用Exonuclease Ⅰ和Exonuclease Ⅲ對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行處理，除去連接產(chǎn)物中未成環(huán)的探針和DNA模板[16]。20 μL酶切體系：連接產(chǎn)物10 μL，20 U/μL Exonuclease Ⅰ 1 μL，100 U/μL Exonuclease Ⅲ 1 μL，10×buffer(67 mmol/L Glycine-KOH、1 mmol/L DTT、6.7 mmol/L MgCl2)2 μL,用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)至20 μL。酶切體系37 ℃反應(yīng)2 h，然后85 ℃溫育20 min后停止酶切。

1.2.5 HRCA擴(kuò)增反應(yīng)

HRCA反應(yīng)的25 μL擴(kuò)增體系：經(jīng)外切酶處理后的連接產(chǎn)物4 μL，10 μmol/L P1 1.25 μL，10 μmol/L P2 1.25 μL，10 μmol/L dNTPs 0.75 μL，4 U/μLBstDNA 聚合酶1 μL，10×BstDNA polymerase buffer(20 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L KCl、10 mmol/L (NH4)2SO4、2 mmol/L MgSO4、0.1%Triton X-100) 2.5 μL，用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)至25 μL。在63 ℃下擴(kuò)增反應(yīng)1 h。

1.2.6 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳

取5 μL HRCA產(chǎn)物用2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖電泳檢測(cè)，溴化乙錠染色，紫外凝膠成像系統(tǒng)照相分析。

1.2.7 HRCA檢測(cè)的特異性

分別選取了副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)、遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiellatarda)、維氏氣單胞菌(Aeromonasvickers)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、哈維氏弧菌(Vibrioharvey)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)7種菌株，劃線挑菌后過(guò)夜培養(yǎng)，經(jīng)平板計(jì)數(shù)法確定濃度后，稀釋為1×108cfu/mL的菌液。然后，提取DNA，按照上述步驟進(jìn)行連接、酶切、擴(kuò)增，進(jìn)行HRCA檢測(cè)，同時(shí)以嗜水氣單胞菌菌株B11作為陽(yáng)性對(duì)照、無(wú)菌雙蒸水作為空白對(duì)照，產(chǎn)物用2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.8 HRCA檢測(cè)的靈敏度

選用嗜水氣單胞菌B11作為陽(yáng)性菌，活化菌株，制作成1×106cfu/mL的菌懸液。用0.9%(體積分?jǐn)?shù))的無(wú)菌生理鹽水對(duì)嗜水氣單胞菌的菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)♂尩?×102cfu/mL,對(duì)不同稀釋度的菌液提取DNA作為模板，在1×102～1×106cfu/mL范圍內(nèi)進(jìn)行HRCA檢測(cè)，以確定HRCA檢測(cè)體系的靈敏度。

1.2.9 HRCA實(shí)際樣品檢測(cè)

將購(gòu)買(mǎi)的美洲鰻鱺(Anguillarostrata)經(jīng)饑餓處理3 d后，將嗜水氣單胞菌用0.9%(體積分?jǐn)?shù))無(wú)菌生理鹽水稀釋為2×107cfu/mL，注射到鰻鱺腹腔內(nèi)，同時(shí)設(shè)立1組只注射0.9%無(wú)菌生理鹽水[17]的作為對(duì)照組。7 d后選擇無(wú)明顯發(fā)病的鰻鱺，取其0.5 g肌肉組織，勻漿后沸水加熱10 min，取上清液2.5 μL用于檢測(cè)[11]。

2 結(jié)果

2.1 嗜水氣單胞菌HRCA檢測(cè)體系的建立和優(yōu)化

2.1.1 鎖式探針濃度的確定

按照1.2.3所述的鎖式探針連接反應(yīng)條件，設(shè)置6個(gè)鎖式探針濃度分別為25 pmol/L、250 pmol/L、2.5 nmol/L、25 nmol/L、250 nmol/L和2.5 mmol/L，連接反應(yīng)后依據(jù)1.2.4和1.2.5步驟進(jìn)行酶切與HRCA擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)物的電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。當(dāng)探針濃度大于或等于25 nmol/L時(shí)，條帶亮度相近并且清晰；而低于此濃度，電泳條帶基本看不到。因此選擇25 nmol/L作為反應(yīng)體系的探針濃度。此外，凝膠電泳結(jié)果呈階梯狀分布，條帶的大小依次為102 bp的整數(shù)倍，這證明電泳的結(jié)果與理論值是一致的。

2.1.2 HRCA擴(kuò)增溫度的確定

HRCA反應(yīng)中不同擴(kuò)增溫度的結(jié)果見(jiàn)圖2。溫度為51 ℃和54 ℃時(shí)，沒(méi)有條帶； 57 ℃時(shí)，開(kāi)始有條帶產(chǎn)生，但不夠清晰；60 ℃和63 ℃時(shí)，條帶最為清晰；66 ℃時(shí)，條帶模糊不清，沒(méi)有階梯狀條帶產(chǎn)生。故選擇63 ℃作為擴(kuò)增的溫度。

2.2 HRCA檢測(cè)的特異性結(jié)果

HRCA特異性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。8株實(shí)驗(yàn)菌株中，只有嗜水氣單胞菌B11可以檢測(cè)出，其余7株對(duì)照菌株均不能檢出。這表明，HRCA檢測(cè)體系可以特異性地檢測(cè)出嗜水氣單胞菌，特異性良好，適用于嗜水氣單胞菌的檢測(cè)。

2.3 HRCA檢測(cè)的靈敏度結(jié)果

HRCA檢測(cè)的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。其最低檢測(cè)濃度為1×103cfu/mL，在該濃度時(shí)可以檢測(cè)得到，但條帶較微弱；小于該濃度時(shí)條帶已經(jīng)不可見(jiàn)；濃度在1×104～1×106cfu/mL時(shí)，條帶清晰可見(jiàn)。而常規(guī)的PCR檢測(cè)手段只能檢測(cè)到3×104cfu/mL[18]。

2.4 HRCA實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

嗜水氣單胞菌感染美洲鰻鱺的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖5)表明，感染的美洲鰻鱺樣品條帶清晰可見(jiàn)，注射無(wú)菌生理鹽水的健康鰻鱺樣品無(wú)條帶出現(xiàn)。這證明HRCA法能夠從感染的鰻鱺樣品中檢測(cè)出嗜水氣單胞菌，該法可用于水產(chǎn)生物病原菌感染的檢測(cè)。

3 討論

滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)依賴(lài)于鎖式探針對(duì)目標(biāo)DNA的特異性結(jié)合[19]，只有探針兩端的捕捉序列與待檢的目標(biāo)序列完全互補(bǔ)結(jié)合[20]，T4 DNA 連接酶才能將鎖式探針連接環(huán)化，若有一個(gè)堿基錯(cuò)配，探針的連接就無(wú)法進(jìn)行[21]，從而保證了檢測(cè)的特異性。此外，HRCA檢測(cè)的實(shí)質(zhì)是對(duì)連接成環(huán)的探針進(jìn)行擴(kuò)增[22]，并非對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增[23]，既減少了交叉污染，也最大限度地減少了實(shí)際樣品中抑制因子對(duì)檢測(cè)的影響[24]，從而放大了信號(hào)值，有助于檢測(cè)靈敏度的提高。

由于HRCA法擴(kuò)增的是環(huán)狀探針，因此沒(méi)有成環(huán)的線性探針和目標(biāo)DNA會(huì)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)生背景信號(hào)，影響靈敏度，為此本研究加入了Exonuclease Ⅰ和Exonuclease Ⅲ,特異性地降解掉了未成環(huán)的單鏈探針[25]和未反應(yīng)的DNA模板[26]，效果良好。鎖式探針的濃度對(duì)HRCA檢測(cè)至關(guān)重要。濃度過(guò)低，成環(huán)的探針少，導(dǎo)致HRCA的檢測(cè)信號(hào)低，不能如實(shí)反映嗜水氣單胞菌的真實(shí)含量；濃度過(guò)高，有可能降解不完全，使得背景信號(hào)增大。本檢測(cè)的最佳濃度為25 nmol/L。HRCA的反應(yīng)溫度包含鎖式探針連接溫度和擴(kuò)增反應(yīng)溫度。連接溫度是由T4 DNA連接酶決定。T4 DNA連接酶有最適反應(yīng)溫度，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，其最適反應(yīng)溫度為16 ℃。而擴(kuò)增反應(yīng)溫度是由Bst DNA 聚合酶的最適反應(yīng)溫度決定的。實(shí)驗(yàn)證明，在60 ℃和63 ℃時(shí)，條帶最為清晰，而超出了此溫度范圍，則沒(méi)有條帶或者條帶不清晰，即60～63 ℃為Bst DNA 聚合酶的最適溫度。因此，本研究選用63 ℃為HRCA反應(yīng)的擴(kuò)增溫度。

用分子生物學(xué)手段檢測(cè)嗜水氣單胞菌，相較于傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)和免疫法，具有突出的優(yōu)點(diǎn)——靈敏度高、特異性強(qiáng)，但其缺點(diǎn)也顯而易見(jiàn)——需要較為昂貴的變溫儀器。對(duì)于PCR方法[27],如果要做不同菌的高通量檢測(cè)，需要設(shè)計(jì)不同的引物進(jìn)行多重PCR，這不可避免地產(chǎn)生多重PCR假陽(yáng)性和不同引物相互影響擴(kuò)增效率的問(wèn)題。而采用HRCA法檢測(cè)嗜水氣單胞菌，其靈敏度為1×103cfu/mL，高于免疫法的4.0×104cfu/mL[3]和PCR法的3×104cfu/mL[18]；并且不需要PCR儀，采用恒溫水浴鍋即可進(jìn)行擴(kuò)增，大大簡(jiǎn)化了處理步驟；此外，相較于PCR方法，鎖式探針的設(shè)計(jì)在保證中間連接序列不變的前提下，針對(duì)不同目標(biāo)序列設(shè)計(jì)不同的捕捉序列，即可用一對(duì)引物擴(kuò)增多種探針[28]，可高通量[29]、多靶標(biāo)檢測(cè)[30]，克服了多重PCR進(jìn)行多種病菌檢測(cè)時(shí)的不利影響。

4 結(jié)論

本文首次應(yīng)用HRCA法進(jìn)行了嗜水氣單胞菌的檢測(cè)。該法靈敏度高、特異性強(qiáng)，樣品處理簡(jiǎn)單，不需要昂貴的儀器，有可能在水產(chǎn)養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中得到推廣應(yīng)用。基于鎖式探針的特點(diǎn)，后續(xù)研究可以根據(jù)中間連接序列設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物，針對(duì)不同菌的目標(biāo)序列設(shè)計(jì)不同的捕捉序列，實(shí)現(xiàn)多種水產(chǎn)病原菌的高通量檢測(cè)，為水產(chǎn)病害的鑒定及制定治療方案提供更簡(jiǎn)潔、快速、高效的檢測(cè)方法。