C-Kit、父系表達(dá)基因10在原發(fā)性肝癌患者中的表達(dá)及與臨床特征和預(yù)后的關(guān)系

張曉虎，裴旭東，閃海霞，朱喜增

南陽(yáng)市中心醫(yī)院感染科，河南 南陽(yáng) 473001

原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）是指發(fā)生于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞的惡性腫瘤，是中國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。據(jù)調(diào)查顯示，近年來(lái)中國(guó)PLC的發(fā)病率呈逐漸上升且年輕化趨勢(shì)。由于PLC早期無(wú)典型癥狀，患者常在中晚期出現(xiàn)肝區(qū)持續(xù)性疼痛、肝大、黃疸、肝功能減退、門脈高壓綜合征等，若不及時(shí)治療，將對(duì)患者的生命安全造成嚴(yán)重威脅。目前，早期診斷和評(píng)估PLC患者病情并采取治療措施是提高PLC診療率的關(guān)鍵。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤的發(fā)生與遺傳印記相關(guān)基因及原癌基因密切相關(guān)。因此，PLC的早期診斷及早期治療可從分子水平研究入手。C-Kit作為重要的細(xì)胞原癌基因，是酪氨酸激酶受體蛋白家族的一員，參與造血干細(xì)胞的分化、增殖，與胃腸間質(zhì)瘤及其他腫瘤密切相關(guān)，印記基因父系表達(dá)基因10（paternally expressed gene 10，PEG10）具有高度的組織特異性，隨著腫瘤分化程度的增加，其表達(dá)水平升高，已被證實(shí)與腫瘤進(jìn)展具有相關(guān)性。但目前臨床上關(guān)于PEG10基因與PLC的相關(guān)性尚未見(jiàn)明確報(bào)道。本研究探討了C-Kit和PEG10蛋白在PLC患者中的表達(dá)及與臨床特征和預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年2月至2017年2月南陽(yáng)市中心醫(yī)院收治的接受肝穿刺治療且經(jīng)病理組織檢查確診的PLC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)肝穿刺治療且術(shù)后病理學(xué)檢查確診為PLC。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并心、肝、腎、肺疾病；術(shù)后隨訪資料不完整。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入90例患者。其中，女44例，男46例；年齡32～76歲，平均（56.06±6.32）歲；臨床分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期23例，Ⅲ期21例，Ⅳ期19例；組織學(xué)類型：肝細(xì)胞癌48例，膽管細(xì)胞癌42例。收集PLC患者的PLC組織90例及癌旁正常組織90例。

1.2 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)C-Kit和PEG10蛋白表達(dá)

采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法（streptavidin-perosidase，SP）檢測(cè)PLC組織和癌旁正常組織中C-Kit和PEG10蛋白的表達(dá)情況。將石蠟包埋的組織標(biāo)本連續(xù)2 μm切片，60℃烘烤，二甲苯脫蠟，浸泡3次，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌3次；滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑，室溫孵育15 min，PBS沖洗；滴加一抗（C-Kit或PEG10多克隆抗體，濃度為1∶100），室溫孵育1 h，PBS沖洗。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠/兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）聚合物，室溫孵育30 min；滴加山羊抗兔二抗，室溫孵育30 min；二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，中性樹(shù)膠封片。采用PBS代替一抗作為對(duì)照。

1.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷

隨機(jī)選擇每張切片的5個(gè)視野，根據(jù)染色強(qiáng)度和視野中陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分。依據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分：＜25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分相乘，0～1分為陰性（-），2～4分為弱陽(yáng)性（+），5～8分為中等陽(yáng)性（++），9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。其中，陰性（-）和弱陽(yáng)性（+）為低表達(dá)，中等陽(yáng)性（++）和強(qiáng)陽(yáng)性（+++）為高表達(dá)。

1.4 觀察指標(biāo)及隨訪

記錄患者的臨床資料，包括年齡、性別、臨床分期、組織分化程度、甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）水平、組織學(xué)類型、預(yù)后評(píng)分。采用格拉斯哥昏迷評(píng)分法（Glasgow coma scale，GCS）根據(jù)患者睜眼、語(yǔ)言、肢體運(yùn)動(dòng)等進(jìn)行預(yù)后評(píng)分，總分為15分，評(píng)分越高，提示意識(shí)狀態(tài)越好。記錄C-Kit和PEG10蛋白表達(dá)情況及預(yù)后情況。比較PLC組織和癌旁正常組織中C-Kit和PEG10蛋白的表達(dá)情況，比較不同臨床特征PLC患者PLC組織中C-Kit和PEG10蛋白的表達(dá)情況。所有患者治療結(jié)束后均隨訪3年，隨訪截止時(shí)間為2020年2月29日，隨訪率為100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PLC 組織和癌旁正常組織中C-Kit和PEG10蛋白表達(dá)情況的比較

PLC組織中C-Kit蛋白的高表達(dá)率為75.56%（68/90），明顯高于癌旁正常組織的13.33%（12/90），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ=70.560，P＜0.01）；PLC組織中PEG10蛋白的高表達(dá)率為81.11%（73/90），明顯高于癌旁正常組織的8.89%（8/90），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ=94.837，P＜0.01）。（表1、表2）

表1 PLC組織和癌旁正常組織中C-Kit蛋白的表達(dá)情況

表2 PLC組織和癌旁正常組織中PEG10蛋白的表達(dá)情況

2.2 不同臨床特征PLC患者PLC組織中C-Kit和PEG10蛋白表達(dá)情況的比較

不同年齡、性別、組織學(xué)類型的PLC患者PLC組織中C-Kit和PEG10蛋白表達(dá)情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、AFP水平＞200 ng/ml的PLC患者PLC組織中C-Kit蛋白高表達(dá)率分別明顯高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、AFP水平≤200 ng/ml的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=14.739、10.222、10.458，

P

＜0.01）；臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、AFP水平＞200 ng/ml的PLC患者PLC組織中PEG10蛋白高表達(dá)率分別明顯高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、AFP水平≤200 ng/ml的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=12.622、7.626、8.506，

P

＜0.01）。（表3）

表3 不同臨床特征PLC患者PLC組織中C-Kit和PEG10蛋白的表達(dá)情況（n=90）

2.3 預(yù)后情況

3年隨訪結(jié)束后，90例PLC患者的3年生存率為51.11%（46/90）。

2.4 PLC 患者預(yù)后影響因素的單因素分析

不同年齡、性別PLC患者的3年生存率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、預(yù)后評(píng)分＜7分、C-Kit蛋白高表達(dá)、PEG10蛋白高表達(dá)、AFP水平＞200 ng/ml的PLC患者的3年生存率分別明顯低于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、預(yù)后評(píng)分≥7分、C-Kit蛋白低表達(dá)、PEG10蛋白低表達(dá)、AFP水平≤200 ng/ml的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表4）

表4 PLC患者預(yù)后影響因素的單因素分析（n=90）

2.5 PLC 患者預(yù)后影響因素的多因素分析

多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、預(yù)后評(píng)分＜7分、C-Kit蛋白高表達(dá)和PEG10蛋白高表達(dá)均是PLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（

P

＜0.05）。（表5）

表5 PLC患者預(yù)后影響因素的多因素分析（n= 90）

3 討論

據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，全球消化系統(tǒng)惡性腫瘤中肝癌的病死率居第3位，中國(guó)作為肝癌的高發(fā)區(qū)，肝癌死亡例數(shù)占全球總死亡例數(shù)的46%左右。因此，對(duì)PLC的早期診斷、治療及相關(guān)分子生物學(xué)研究一直是臨床研究熱點(diǎn)。

隨著生物學(xué)研究的不斷深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)相關(guān)蛋白改變?cè)赑LC的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，且與PLC的預(yù)后相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，PLC組織中C-Kit和PEG10蛋白的高表達(dá)率均明顯高于癌旁正常組織，且臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、AFP水平＞200 ng/ml的PLC患者PLC組織中C-Kit和PEG10蛋白高表達(dá)率分別明顯高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、AFP水平≤200 ng/ml的患者。說(shuō)明PLC的發(fā)生和發(fā)展與C-Kit和PEG10蛋白有著密切聯(lián)系。PEG10是一種新發(fā)現(xiàn)的遺傳印記相關(guān)基因，研究發(fā)現(xiàn)，與p53、p16、c-myc等腫瘤相關(guān)基因比較，PEG10具有更高的肝癌組織特異性，其具有作為新的肝癌早期診斷標(biāo)志物的潛力。有學(xué)者采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)肝癌中PEG10蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中PEG10蛋白表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，且隨著肝癌分化程度的降低，其表達(dá)增加，與本研究結(jié)果一致。C-Kit基因是HZ4貓科肉瘤病毒kit癌基因的同源物，位于人染色體4q12-13。C-Kit是白色斑點(diǎn)顯性基因的等位基因，屬于原癌基因，其產(chǎn)物是Ⅲ型酪氨酸激酶，編碼145 kD的跨膜糖蛋白——酪氨酸激酶受體，后者即為C-Kit受體。周芳穎等研究顯示，C-Kit基因突變可刺激腫瘤細(xì)胞的持續(xù)性增殖和抗凋亡信號(hào)的失控，有利于腫瘤的惡性克隆。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的Cajal細(xì)胞都表達(dá)C-Kit，黑色素瘤、生殖細(xì)胞及造血細(xì)胞中也有C-Kit表達(dá)。由此可知C-Kit與PLC具有相關(guān)性，與本研究結(jié)論一致。

本研究結(jié)果還顯示，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、預(yù)后評(píng)分＜7分、C-Kit蛋白高表達(dá)和PEG10蛋白高表達(dá)均是PLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。考慮原因如下：隨著腫瘤臨床分期的升高，患者病情加重，導(dǎo)致預(yù)后情況較差；組織分化程度較低時(shí)，肝癌細(xì)胞的分化能力增強(qiáng)，惡性程度增高，導(dǎo)致患者的預(yù)后較差；作為判斷預(yù)后的預(yù)后評(píng)分可在一定程度上反映病情嚴(yán)重程度，預(yù)后評(píng)分越低，說(shuō)明患者病情越重，其生存率及預(yù)后均會(huì)受到影響。

綜上所述，C-Kit和PEG10在PLC組織中高表達(dá)，其表達(dá)情況與患者的臨床特征及預(yù)后有關(guān)，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、預(yù)后評(píng)分＜7分、C-Kit蛋白高表達(dá)和PEG10蛋白高表達(dá)均是PLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，C-Kit和PEG10蛋白可作為理想的PLC預(yù)后標(biāo)志物。