液體活檢在食管鱗狀細胞癌中的應用及展望△

努爾斯曼古麗·買買提明，張莉

新疆醫科大學第一附屬醫院綜合內一科，烏魯木齊 830054

食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，是全球第八大常見惡性腫瘤及第六大常見惡性腫瘤死亡原因，每年有超過45.6萬新發病例及40萬死亡病例，目前患者的5年生存率約為20%。食管癌常見的病理類型包括鱗狀細胞癌和腺癌，其中鱗狀細胞癌占食管癌的90%。目前，食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）的具體發病原因仍未完全闡明，目前的研究顯示其發生與遺傳、生活和飲食習慣以及慢性損傷等因素均有關，是影響人類健康的一大殺手。ESCC起源于食管黏膜上皮，是常見的消化道惡性腫瘤之一，也是一種生長迅速、淋巴結轉移率高的侵襲性惡性腫瘤，多在70歲左右時發病，且男性多見，男女比例為2.5∶1。ESCC因起病隱匿、缺乏特異性導致其早期診斷困難，當患者出現進行性吞咽困難、體重下降等癥狀而就診時常為中晚期，且因食管內有豐富的淋巴脈管網絡，導致早期行根治性手術治療后仍有部分患者出現復發及遠處轉移。近年來的研究表明，從腫瘤組織脫落進入淋巴脈管系統的循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）可導致腫瘤復發及轉移，因此導致患者預后差、病死率高。目前常用的食管癌治療方法包括手術、局部放療、全身化療、靶向治療、免疫治療等，但這些治療效果仍不理想，患者術后及放化療后易出現復發及轉移。同時，復發轉移后可選擇的治療方案有限，從而導致進展性ESCC的治療成為臨床上的一大難題。對于ESCC患者，如果能夠早期診斷并接受治療可大大提高患者的生存率。因此，尋找一種更敏感、安全且能夠早期反映腫瘤進展的方法成為ESCC診斷和治療的關鍵。相關研究結果證實，檢測循環腫瘤標志物是解決該難題的一個有效方案。腫瘤在發生、發展過程中需要通過血液獲取營養物質，壞死、凋亡后的代謝產物也會釋放入血從而排出體內，因此血液是病灶組織以外的最理想檢測標本，CTC、循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環腫瘤RNA（circulating tumor RNA，ctRNA）及腫瘤代謝產物中篩選的分子生物標志物已經在一些惡性腫瘤的診斷和治療中發揮了一定的作用。基于血液的液體活檢是一種低創檢查，可通過檢測血液中的循環標志物獲取與原發灶疾病相關的信息，并動態觀察疾病的演變過程。本文圍繞液體活檢技術在ESCC中的最新研究進展作一綜述，同時探討循環腫瘤標志物在ESCC診斷、治療及預后判斷中的作用及局限性。

1 液體活檢

液體活檢是通過檢測人體不同體液（包括血液、尿液、糞便、唾液或腦脊液等）中腫瘤相關生物標志物來獲取疾病相關信息的方法，最常用的體液為血液，通過檢測血液中從原發性或轉移性腫瘤病灶脫落的腫瘤細胞、DNA、RNA等，可識別腫瘤相關突變的存在并獲得疾病最初治療前后、復發和演變的信息。與傳統活檢相比，液體活檢是通過非侵入性的方式檢測患者血液中的DNA、RNA或蛋白質，可在疾病不同階段連續進行，易被患者接受，可以動態監測疾病變化情況并根據結果實時調整治療方案及判斷預后。

2 循環腫瘤標志物

循環腫瘤標志物包括從原發灶及轉移灶脫落入血的單個腫瘤細胞凋亡或腫瘤組織壞死釋放入血的DNA或RNA、外泌體、腫瘤相關血小板（tumor-educated blood platelet，TEP）、循環腫瘤相關微粒等，這些不同的生物標志物均攜帶與原發腫瘤相關的遺傳及變異等信息，在腫瘤的診斷和治療中發揮重要作用。

2.1 CTC

CTC來源于腫瘤組織，原位腫瘤細胞通過上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）并侵入血液循環從而形成CTC。1869年，Thomas在1例轉移性惡性腫瘤患者的血液中發現了CTC。腫瘤細胞發生EMT后，細胞黏附分子表達減少，獲得間充質細胞表型，細胞的運動能力增強，從而促進腫瘤細胞的侵襲和播散，導致腫瘤的早期轉移和復發。Lianidou等研究表明，CTC可作為多種實體瘤的生物標志物，與實體瘤的早期診斷、預后及治療相關。目前CTC主要通過基于物理學特征及免疫學特征的方法進行分離及富集，由于具有富集純度高以及能夠保持細胞活性等優勢，免疫學富集方法相較于傳統物理學富集方法應用更為廣泛。Li等采用免疫磁珠分離法（magnetic activated cell sorting，MACS）檢測ESCC患者血液中的CTC，發現140例ESCC患者中，62例（44.3%）患者檢測到CTC，且CTC數量與ESCC患者的臨床分期有關（P=0.013），提示CTC陽性是ESCC患者的獨立預后生物標志物。Han等通過優化的CanPatrolCTC分型檢測系統分析21例ESCC患者的血液樣本，共檢測到129個CTC，結果發現CTC數量與患者的TNM分期有關。Han等采用上皮腫瘤細胞大小分離法（isolation by size of epithelial tumor cell，ISET）測定60例ESCC患者治療前的CTC，結果提示患者的無進展生存期（progression-free survival，PFS）與CTC數量呈負相關，多因素分析結果顯示，CTC值＞2是腫瘤復發的獨立預后指標。臨床上檢測、計數和分離CTC的潛在應用價值可能包括監測復發或判斷預后，實時監測治療效果。

CTC是完整、有活性的細胞，包含腫瘤的全基因組、蛋白質組等信息，是研究腫瘤組織信息的豐富來源，通過檢測CTC有助于早期發現腫瘤侵襲相關基因特征。通常情況下，進入血液的CTC會在短期內被免疫細胞殺傷，只有具有高度轉移潛能的CTC才可以通過免疫逃逸存活下來。通過分離血液中的這些CTC并應用高通量測序技術（next generation sequencing，NGS）獲取CTC的基因組學及蛋白質組學信息，通過生物信息學分析腫瘤發生侵襲轉移的代謝途徑和信號通路，可能為腫瘤的治療提供潛在靶點。

雖然CTC在ESCC的診療中具有很大的應用前景，但是其在臨床中的可行性仍面臨挑戰，主要是由于CTC的檢出率低、特異性低、個體差異大、費用高，在應用標準方案收集血液樣本保證質量一致的前提下，加工前后及過程中仍有可能導致細胞損傷，使得CTC的分離成為一大難題。此外，對單個CTC進行基因組學及蛋白質組學研究對技術及人員的要求較高，且耗費大，在臨床上的應用受到一定的限制。因此，需要繼續探索簡單、可靠的方法提高CTC的檢出率。

2.2 ctDNA

游離DNA（cell free DNA，cfDNA）是存在于體液中的細胞外DNA，來源于正常細胞和凋亡、壞死的腫瘤細胞，而ctDNA是其中的一部分，既攜帶腫瘤細胞的基本遺傳信息，又攜帶基因突變后的信息，包含點突變、重排、擴增甚至基因拷貝數變異。1948年Mandel和Metais首次報道了外周血中存在cfDNA，目前cfDNA已成為許多醫學學科的熱門研究領域。研究表明，通過測量ctDNA等位基因突變片段可以獲得定量信息，用于腫瘤診斷并反映腫瘤負荷情況。Zhou等對原發性乳腺癌患者的腫瘤組織DNA及ctDNA進行分析，結果發現腫瘤組織DNA與ctDNA的基因突變頻率顯著相關（P＜0.01），并且在局部晚期（P=0.0085）或轉移（P=0.0136）的乳腺癌患者血液中檢測到的ctDNA最大變異等位基因頻率更高，在大多數乳腺癌患者中能夠檢測到與腫瘤組織DNA一致的ctDNA片段，提示能夠采用非侵入性的基因組譜分析原發腫瘤相關變異信息。Chae等回顧性分析了136例非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者血液中的ctDNA，結果發現較高濃度的ctDNA與較短的PFS和總生存期（overall survival，OS）有關（P＜0.01）。

Luo等通過對ESCC組織、癌旁組織和正常組織以及手術前和手術后的血漿進行測序，分析了ctDNA在ESCC中的特異性和作用，結果證明利用ctDNA檢測ESCC和監測治療效果具有可行性。Azad等通過對食管癌患者放化療前后及健康對照組血液的DNA進行腫瘤個性化深度測序（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq），發現放化療后ctDNA的檢出率與腫瘤進展（P＜0.01）、遠處轉移（P＜0.01）和較短的生存期（P＜0.01）有關。提示ctDNA可反映食管癌相關的基因信息，并與其發生、發展密切相關，有望成為反映食管癌治療效果及預后的生物標志物。

然而，ctDNA的檢測面臨著巨大挑戰，很大程度上是因為ctDNA通常只占總cfDNA的一小部分（＜1.0%），導致分辨困難、檢測率較低，應用標準的測序方法（如Sanger測序或焦磷酸測序）只能在腫瘤負荷重的患者中檢測到衍生的突變片段，導致提供的信息不全面；雖然ctDNA可以實時反映機體的全身情況，但因其在血液中的半衰期較短，導致檢測困難，因此限制了其在臨床上的廣泛應用。

2.3 ctRNA

ctRNA是來源于腫瘤細胞的游離RNA（cell free RNA，cfRNA）的一部分。幾乎所有已知類型的RNA都存在于體循環中，且每一類RNA都有可能成為惡性腫瘤生物標志物。ctRNA主要分為信使 RNA（messenger RNA，mRNA）、微小 RNA（microRNA，miRNA）和長鏈非編碼 RNA（long noncoding RNA，lncRNA）。其中，miRNA是一類長度為18～22 bp的高度保守、內源性非編碼小分子RNA，通過降解或抑制靶mRNA完成基因表達的轉錄后水平調控，在正常組織和腫瘤組織的動態平衡和細胞間通訊中具有關鍵作用。研究證實，miRNA與腫瘤發生和抑制有關，并且可以作為腫瘤診斷、檢測和預后的重要生物標志物。目前為止，已在人類血液中鑒定出2500多個不同的miRNA，每個miRNA可直接或間接調節數百個靶基因，從而調節靶細胞的增殖、分化、DNA修復和凋亡等過程。

隨著基因芯片技術的日益發展，循環miRNA在腫瘤的早期診斷、預后判斷及治療中顯現出良好的應用前景。在ESCC中，miRNA通過調節癌基因和抑癌基因的表達，影響ESCC細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲能力，在ESCC的發病機制中發揮著重要作用。Shen等研究了96例ESCC患者與78例健康者的血清miRNA表達水平，結果發現，ESCC患者的血清miRNA-16-5p、miRNA-197-5p、miRNA-451a和miRNA-92a-3p表達水平明顯升高[曲線下面積（area under the curve，AUC）=0.856，95%CI：0.794～0.905，P＜0.01]，具有作為 ESCC 診斷標志物的潛力。He等通過檢測70例ESCC患者和40例健康者血漿中miRNA-20a和let-7a的表達水平，結果發現，ESCC患者血漿中miRNA-20a呈現明顯高表達，let-7a則呈現明顯低表達，且其表達水平與腫瘤分期有關（P＜0.05）。此外，miRNA-21在ESCC中通過抑制胱天蛋白酶（caspase）而發揮作用，且與健康對照組相比，miRNA-21的表達水平在ESCC患者血液中持續上調，然而并不是所有的miRNA表達上調。ESCC中miRNA-21已被證實是預測總體生存率及治療反應的特異性腫瘤標志物。雖然一些研究得出了同樣的結論，但單個miRNA在腫瘤診斷及預后中的價值仍需進一步證實。

循環miRNA主要來源于以下幾條途徑：①蛋白質-miRNA復合體以及脂蛋白復合體（例如高密度脂蛋白）中的主動分泌；②通過膜囊泡的主動分泌；③當多泡體與細胞膜融合時通過外質體的主動分泌；④來源于細胞壞死和細胞凋亡的被動分泌。miRNA在血液或體液中可長期穩定存在，煮沸、反復凍融、極端酸堿環境、長期冰凍保存等方法均不會損失循環miRNA，目前已成功應用定量逆轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術提取miRNA，其穩定性和特異性均較高。循環miRNA已表現出明顯優勢，包括在各種類型體液中的穩定性高，可抵抗內源性核糖核酸酶消化，可應用低成本、易于分析和敏感的檢測方法，以上優勢使循環miRNA成為潛在的新興生物標志物。

2.4 外泌體

外泌體是被膜包裹的胞外囊泡，一般直徑為40～100 nm，多種細胞在正常及病理狀態下均主動分泌外泌體，它攜帶了各種細胞成分如蛋白質、核酸（mRNA、DNA、非編碼RNA）和脂類。外泌體可以介導細胞間通訊，通過釋放包含的生物因子，從而改變受體細胞的分子活動。以往的研究已證明，惡性腫瘤細胞會增加外泌體的排放，包裹在外泌體中的miRNA被釋放進入體液參與腫瘤的生物學行為調控。研究表明，ESCC細胞釋放的外泌體與腫瘤組織本身具有相似的成分，其釋放的內容可能會影響宿主的免疫反應，如抵抗化療藥物、促進腫瘤增殖及侵襲等。因此，外泌體的miRNA表達譜是一個潛在的生物標志物，可以提供腫瘤分級和預后相關信息，從而有助于制訂更好的腫瘤個體化治療方案。

已有研究表明，黑色素瘤和纖維肉瘤分泌的外泌體釋放的膜型基質金屬蛋白酶-1（membrane type 1-matrix metalloproteinase，MT1-MMP）會導致膠原蛋白降解，促進腫瘤侵襲和轉移。也有研究顯示，高侵襲性的Hs578T三陰性乳腺癌細胞的外泌體能夠顯著增強乳腺癌細胞SKBR3、MDA-MB-231和HCC1954的侵襲和遷移能力。有關食管癌外泌體研究的報道較少，Li等研究發現，ESCC患者血清外泌體中的miRNA-21被受體細胞攝取后通過靶向程序性死亡受體4（programmed cell death 4，PDCD4）并激活下游的c-Jun氨基末端激酶（c-Jun NH2-terminal kinase，c-JNK）信號通路，從而促進受體細胞的侵襲和遷移。Qiu等分析了125例ESCC患者和60例健康者血清外泌體中miRNA-182的表達水平，結果發現，外泌體miRNA-182水平有助于區分健康者與ESCC患者（AUC=0.837，95%CI：0.776～0.887）；此外，高濃度外泌體miRNA-182組患者的OS和PFS均明顯短于低濃度外泌體miRNA-182組（P＜0.05），因此血清外泌體miRNA-182可能是預測ESCC不良預后的有效標志物。目前仍需要更多的研究驗證外泌體分析的有效性和可靠性。

3 小結

綜上所述，液體活檢可以作為一種新型的ES-CC檢測方法，能夠彌補傳統活檢創傷大且可重復性差等缺點，且通過分析血液中腫瘤相關生物標志物，可動態、準確地反映腫瘤進展情況。此外，液體活檢提供了一種更安全、更方便的技術來獲取腫瘤相關分子信息，可以低創動態地對疾病進行早期診斷，幫助臨床醫師及時調整治療方案并進一步研究疾病的發生發展機制，且有助于靶向藥物的研發。然而，液體活檢在臨床中的實際應用仍存在爭議，目前仍缺乏ESCC特異性生物標志物，以上研究結果尚不能提供有力的結論證明腫瘤生物標志物檢測與疾病參數的相關性。此外，基于液體活檢的基因檢測需要依靠一些較前沿的技術如二代測序、qRT-PCR等，同時對檢測人員要求高，因而限制了其在臨床中的廣泛應用。因此，需要大量的相關研究驗證液體活檢技術在ESCC患者中的有效性和可靠性，同時需要不斷地開發更簡單、更準確的方法進行生物標志物監測及療效評估等。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突