陳亞柯，徐青青，孫寧，宋洋，邱新光，陳建民

1鄭州大學第一附屬醫院甲狀腺二/疝和腹壁外科，鄭州 450052

2鄭州大學第五附屬醫院保育中心，鄭州 450000

甲狀腺癌是臨床常見的內分泌惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的1%，其發病與地區、種族、性別等諸多因素密切相關，如今全球內甲狀腺癌發病率呈明顯上升趨勢，嚴重威脅患者身心健康。甲狀腺癌根治術是臨床常用治療手段，大部分患者預后良好，總體生存率較高，但有少數患者預后較差。甲狀腺癌術后患者生存時間的影響因素較為復雜，但臨床研究認為，甲狀腺癌細胞黏附性、侵襲轉移能力與腫瘤轉移、術后復發等密切相關，但具體作用機制仍有待研究。性別決定區Y盒轉錄因子 9（sex determining region Y-box transcription factor 9，SOX9）與細胞增殖、分化、遷移等過程均存在聯系。研究證實，SOX9在乳腺癌組織中呈陽性表達，且明顯高于癌旁組織，能夠參與腫瘤發生過程。BECN1是一種抑癌基因，其表達能夠促進腫瘤細胞的降解，抑制腫瘤細胞過度增殖，在腫瘤發生、發展中發揮重要作用。理想的免疫學或基因學標志物對甲狀腺癌的早期診療、療效及預后評估十分關鍵，基于既往研究及上述理論，本研究回顧性探討BECN1、SOX9在甲狀腺癌組織中的表達及與患者臨床特征、預后的關系，以期為甲狀腺癌的臨床診療及預后評估提供理論參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年1月至2017年1月鄭州大學第一附屬醫院收治的甲狀腺癌患者的病歷資料。納入標準：經臨床病理檢查證實為甲狀腺癌；均經甲狀腺癌根治術治療；術前甲狀腺功能正常；術后未接受放化療；病歷資料及隨訪資料完整。排除標準：合并其他惡性腫瘤；放射線暴露史；自身免疫疾病及全身疾病；血液系統疾病；嚴重軀體性疾病；合并心臟病、糖尿病、冠心病等嚴重內科疾病；器質性功能不全或障礙；生存時間不足半年；精神疾病；未完成隨訪。根據納入、排除標準，共納入106例甲狀腺癌患者，取其甲狀腺癌組織及癌旁組織。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 術中獲得甲狀腺癌組織及癌旁組織，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，采用SP免疫組織化學染色法檢測BECN1、SOX9表達情況，組織切片常規脫蠟水化，臨用前常規63℃烤爐烤1 h，二甲苯、無水乙醇以及80%～90%乙醇浸泡，以封閉內源性過氧化物酶活性。微波枸櫞酸鹽抗原修復，降至室溫后磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗3次，每次5 min，滴加阻斷劑，置于室溫下15 min。加一抗（工作濃度1∶600）4℃孵育24 h，PBS洗3次，每次1 min；滴加生物素標記的二抗，室溫孵育30 min，PBS洗3次，每次3 min；滴加SP試劑并于37℃孵育1 h，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復染、脫水、干燥、中性樹脂封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。

陽性標準：根據染色強度及陽性細胞百分比進行半定量分析，每張免疫組化切片隨機選擇5～10個具有代表性的高倍視野進行評估。染色強度：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分；陽性細胞百分比：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。上述兩項積分相加，0～3分為陰性，≥4分陽性。

1.2.2 研究方法 比較甲狀腺癌組織及癌旁組織中BECN1、SOX9表達情況，依據患者入院建立的檔案，收集患者年齡、腫瘤大小、臨床分期、分化程度、淋巴結轉移等臨床特征，并比較分析甲狀腺癌組織中BECN1、SOX9表達與患者臨床特征的關系。

1.2.3 隨訪 術后進行為期3年的隨訪，每3個月進行1次，采用門診隨訪、電話隨訪或走訪等形式，具體包括常規體格檢查、實驗室生化指標檢測、影像學檢查等，隨訪截止時間為2020年1月，記錄所有患者生存時間。采用多因素Logistic回歸模型分析甲狀腺癌患者預后影響因素。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 BECN1、SOX9表達情況的比較

BECN1、SOX9陽性均主要定位于細胞質中。甲狀腺癌組織中SOX9陽性表達率明顯高于癌旁組織，BECN1陽性表達率明顯低于癌旁組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 甲狀腺癌組織及癌旁組織中BECN1、SOX9表達情況的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征甲狀腺癌患者的甲狀腺癌組織中BECN1、SOX9表達情況的比較

不同年齡、病理類型、腫瘤大小甲狀腺癌患者甲狀腺癌組織中BECN1、SOX9陽性表達率比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05）；Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無淋巴結轉移甲狀腺癌患者甲狀腺癌組織中BECN1陽性表達率分別高于Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結轉移患者，差異均有統計學意義（

χ

=15.914、21.626、6.052，

P

＜0.05）；Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無淋巴結轉移甲狀腺癌患者甲狀腺癌組織中SOX9陽性表達率分別明顯低于Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結轉移患者，差異均有統計學意義（

χ

=19.650、13.423、19.501，

P

＜0.01）。（表2）

表2 不同臨床特征甲狀腺癌患者的甲狀腺癌組織中BECN1、SOX9的表達情況（n=106）

2.3 不同BECN1、SOX9表達情況甲狀腺癌患者生存情況的比較

BECN1陽性表達患者的平均生存時間為（35.26±8.39）個月，明顯長于陰性表達患者的（30.16±7.35）個月，差異有統計學意義（

t

=4.707，

P

=0.000）；SOX9陽性表達患者的平均生存時間為（31.20±8.03）個月，明顯短于陰性表達患者的（35.74±6.99）個月，差異有統計學意義（

t

=4.391，

P

=0.000）。

2.4 甲狀腺癌患者預后影響因素的單因素分析

不同年齡、病理類型甲狀腺癌患者3年生存率比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05）；不同臨床分期、腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移狀態、BECN1及SOX9表達情況的甲狀腺癌患者3年生存率比較，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。（表3）

表3 甲狀腺癌患者預后影響因素的單因素分析（n=106）

2.5 甲狀腺癌患者預后影響因素的多因素Logistic回歸分析

將表3中差異有統計學意義的分化程度、淋巴結轉移情況、BECN1表達情況、SOX9表達情況作為自變量，患者預后作為因變量（生存=0，死亡=1）納入多因素Logistic回歸模型，結果顯示，淋巴結轉移、分化程度、BECN1表達及SOX9表達均是甲狀腺癌患者預后的影響因素（

P

＜0.05）。（表4）

表4 甲狀腺癌患者預后影響因素的多因素Logistic回歸分析

3 討論

甲狀腺癌發病隱匿，患者早期無典型臨床特征，確診時腫瘤已發生轉移，臨床療效較差，因此甲狀腺癌的早期、準確診療對于療效、患者預后均十分關鍵。腫瘤標志物的選擇是臨床檢測的研究熱點問題，病理組織活檢是臨床診斷及評估疾病的金標準，但該方式對機體創傷較大，易使病情惡化。常規影像學檢查可能對機體產生放射性損傷，且無法確診腫瘤。免疫治療或基因靶向治療在惡性腫瘤的輔助治療過程中發揮了重要作用，但關于甲狀腺癌靶向治療的研究仍然不足，臨床尚缺乏甲狀腺癌可靠、有效的免疫或基因治療靶點。本研究探討了腫瘤細胞基因調控靶基因及相關蛋白信號通路的變化，以期為甲狀腺癌的發病機制及臨床診療提供理論參考。

BECN1是一種抑癌基因，是首次被發現參與自噬過程的基因，而適度的自噬過程能夠幫助細胞存活，過度自噬則會導致細胞自噬性凋亡。BECN1蛋白在細胞自噬過程中發揮重要作用，研究指出，肺癌、卵巢癌、腦癌等惡性腫瘤中BECN1呈明顯低表達，而在肝癌、胃癌中呈明顯高表達，由此可見，BECN1蛋白在不同腫瘤細胞中發揮作用不同。本研究顯示，BECN1陽性主要定位于細胞質中，甲狀腺癌組織中BECN1陽性表達率明顯低于癌旁組織，說明BECN1在甲狀腺癌中呈低表達，且與甲狀腺癌的發生、發展相關，BECN1表達下調，細胞的自噬反應降低，無法誘導自噬性腫瘤細胞死亡，從而促進腫瘤發生發展；BECN1對腫瘤細胞的凋亡具有促進作用，能夠抑制腫瘤生長；BECN1還可通過影響血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和缺氧誘導因子-2α（hypoxiainducible factor-2α，HIF-2α）抑制血管內皮的增殖、遷移及血管腫瘤新生，阻止腫瘤進展。

SOX9能夠與其他轉錄因子相互作用而調控靶基因表達，其異常表達與多種惡性腫瘤發生、發展密切相關。由于器官及組織的不同，SOX9發揮的作用亦不相同，既能作為致癌基因，又能作為抑癌基因，但SOX9在多數腫瘤中均會發揮致癌基因作用。研究指出，膀胱癌、大腸癌等惡性腫瘤中SOX9呈上調表達，發揮促進腫瘤細胞增殖、遷移的作用；在肺癌、胃癌等組織中，SOX9表達水平明顯上調，其表達水平與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期等密切相關。本研究結果中，SOX9陽性主要定位于細胞質中。甲狀腺癌組織中SOX9陽性表達率明顯高于癌旁組織，說明SOX9能夠參與甲狀腺癌的發生過程，發揮致癌基因作用。SOX9在甲狀腺癌細胞中呈高表達并促進腫瘤細胞的增殖、侵襲，因此推斷敲除SOX9能夠有效抑制甲狀腺癌細胞的增殖。

本研究進一步探討了甲狀腺癌臨床特征與BECN1、SOX9表達的關系，結果顯示，Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無淋巴結轉移的甲狀腺癌患者甲狀腺癌組織中BECN1陽性表達率分別高于Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結轉移患者，SOX9陽性表達率分別明顯低于Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結轉移患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。說明BECN1、SOX9表達與甲狀腺癌患者的臨床分期、腫瘤分化程度及淋巴結轉移狀態密切相關，隨著甲狀腺癌疾病的進展，BECN1陽性表達率逐漸降低，SOX9陽性表達率逐漸升高，兩者均能夠參與甲狀腺癌的發生、發展過程，并作為甲狀腺癌惡性程度評估的重要輔助指標。

本研究還探討了BECN1、SOX9表達與甲狀腺癌患者預后的關系，結果顯示，BECN1陽性表達患者的平均生存時間為（35.26±8.39）個月，明顯長于陰性表達患者的（30.16±7.35）個月，SOX9陽性表達患者的平均生存時間為（31.20±8.03）個月，明顯短于陰性表達患者的（35.74±6.99）個月。提示BECN1低表達、SOX9高表達的甲狀腺癌患者預后較差，BECN1陰性表達或SOX9陽性表達患者大多進展至疾病晚期，且存在淋巴結轉移、腫瘤分化程度較低，因此預后更差。進一步采用多因素Logistic回歸模型分析甲狀腺癌的預后影響因素，結果表明，淋巴結轉移、分化程度、BECN1表達及SOX9表達均是甲狀腺癌預后的影響因素，提示BECN1及SOX9表達與甲狀腺癌預后密切相關，在預測腫瘤轉移及患者預后方面具有一定臨床價值。

綜上所述，甲狀腺癌組織中BECN1陽性表達率較低，SOX9陽性表達率較高，且二者表達均與臨床分期、腫瘤分化程度及淋巴結轉移狀態有關；BECN1、SOX9表達與甲狀腺癌患者預后有關，能夠作為評估腫瘤惡性程度的重要指標，預測患者預后。