膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物1、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物2的表達(dá)及與微血管密度的關(guān)系△

馬建功，王曉斌，侯欣，李明軒，方樹(shù)民，劉亞虎，何承#

河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院1神經(jīng)外科，2腫瘤科，河南 開(kāi)封 475000

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是星形細(xì)胞瘤中惡性程度最高的膠質(zhì)瘤，病情發(fā)展迅速，預(yù)后差。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤多位于皮質(zhì)下，生長(zhǎng)在幕上大腦半球各處，可累及對(duì)側(cè)大腦半球。調(diào)查指出，惡性膠質(zhì)瘤在原發(fā)性惡性腦部腫瘤中的占比約為70%，年發(fā)病率約為5/10萬(wàn)，可隨著年齡的增長(zhǎng)不斷升高，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)病例數(shù)也逐年增多。另有報(bào)道顯示，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在星形細(xì)胞瘤中的占比為60%～75%，復(fù)發(fā)率高，且5年生存率很低。目前人們對(duì)于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)尚淺，有研究指出，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的腫瘤組織中有大量新血管生成，微血管密度（microvessel density，MVD）顯著增加，提示應(yīng)將抗血管生成作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者重要的治療措施。但是目前針對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的常用治療方法效果并不理想，而與新血管生成相關(guān)的因素并未得到全面、有效地控制。基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物2（tissue inhibitor of metalloproteinase 2，TIMP2）均屬于基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制酶，不僅能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，還具有抗纖維化作用，已有報(bào)道證實(shí)在多種惡性腫瘤組織中二者的表達(dá)水平偏高，如乳腺癌、肝癌、星形細(xì)胞瘤等。有研究指出，TIMP1、TIMP2表達(dá)水平越高，惡性腫瘤的惡性程度越高，預(yù)后越差。本研究探討了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中TIMP1、TIMP2的表達(dá)及其與MVD值的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月至2019年12月河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①實(shí)施手術(shù)治療，經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；②手術(shù)切除組織均以石蠟包埋存檔；③組織學(xué)分級(jí)為Ⅲ級(jí)或Ⅳ級(jí)；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他類型腦膠質(zhì)瘤患者；②膠質(zhì)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)患者；③手術(shù)切除組織切緣未見(jiàn)正常組織；④術(shù)前具有抗腫瘤治療史。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入42例患者。其中，男22例，女20例；年齡42～75歲，平均（58.52±8.71）歲；組織學(xué)分級(jí)：Ⅲ級(jí)12例，Ⅳ級(jí)30例；腫瘤部位：額葉28例，頂葉5例，丘腦-基底節(jié)4例，顳葉2例，胼胝體1例，橋腦1例，小腦1例；最大腫瘤直徑為8～75 mm，平均（35.52±5.85）mm。收集患者的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織42例和周圍正常組織42例。

1.2 檢測(cè)方法

采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和周圍正常組織中TIMP1、TIMP2的相對(duì)表達(dá)量。取膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和周圍正常組織，研磨、勻漿、裂解后對(duì)總蛋白進(jìn)行定量，然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜。采用脫脂牛奶封閉，加入鼠抗人TIMP1、TIMP2單克隆抗體，室溫孵育過(guò)夜；加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠TIMP1、TIMP2多克隆抗體，4℃孵育2 h。加入電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）劑，暗室曝光。以β-肌動(dòng)蛋白（βactin）為內(nèi)參，目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

采用免疫組化兩步法檢測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和周圍正常組織中的MVD。采用CD34抗體對(duì)微血管染色，可見(jiàn)棕褐色顆粒，為血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。采用200倍光鏡對(duì)整張切片掃視，確定3個(gè)熱點(diǎn)，即微血管密集區(qū)域，然后用400倍物鏡計(jì)算每個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域中的微血管數(shù)，計(jì)算3個(gè)熱點(diǎn)的平均值記為MVD值。

1.3 觀察指標(biāo)

比較膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和周圍正常組織中TIMP1、TIMP2的相對(duì)表達(dá)量及MVD值；比較不同組織學(xué)分級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中TIMP1、TIMP2的相對(duì)表達(dá)量及MVD值；分析膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中TIMP1、TIMP2表達(dá)與MVD的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和周圍正常組織中TIMP1、TIMP2相對(duì)表達(dá)量及MVD值的比較

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中TIMP1、TIMP2的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于周圍正常組織，MVD值明顯高于周圍正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表1）

表1 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和周圍正常組織中TIMP1、TIMP2相對(duì)表達(dá)量及MVD值的比較（±s）

2.2 不同組織學(xué)分級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中TIMP1、TIMP2相對(duì)表達(dá)量及MVD值的比較

Ⅳ級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中TIMP1、TIMP2的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于Ⅲ級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織，MVD值明顯高于Ⅲ級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表2）

表2 不同組織學(xué)分級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中-TIMP1、TIMP2相對(duì)表達(dá)量及MVD值的比較（±s）

2.3 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中TIMP1、TIMP2的表達(dá)與MVD 的相關(guān)性

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中TIMP1、TIMP2的表達(dá)均與MVD值呈負(fù)相關(guān)（r=-0.796、-0.815，P＜0.01）。

3 討論

原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的分子改變以表皮生長(zhǎng)因子受體擴(kuò)增和過(guò)量表達(dá)為主，可導(dǎo)致表皮生長(zhǎng)因子水平升高，新生血管大量生成，對(duì)腦組織產(chǎn)生浸潤(rùn)性損壞，還可導(dǎo)致頭痛、偏癱、失語(yǔ)、偏盲等。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤多呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，可侵犯幾個(gè)腦葉和深部結(jié)構(gòu)，對(duì)患者的身心健康造成嚴(yán)重危害。盡管目前臨床上常用手術(shù)、放療和化療等方法治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，但效果并不理想，主要原因如下：膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性程度高，臨床治療難度大；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤可生成大量新生血管，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，甚至危及患者的生命安全。然而目前人們對(duì)新生血管生成的機(jī)制認(rèn)識(shí)尚淺，其治療措施也缺乏針對(duì)性。因此該領(lǐng)域工作者應(yīng)積極探索與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者新生血管生成相關(guān)的因素，以期為臨床抗腫瘤治療的研究提供新方向。

新生血管生成是一個(gè)涉及多種細(xì)胞和分子的復(fù)雜過(guò)程，主要包括激活期血管基底膜降解、血管內(nèi)皮細(xì)胞激活、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、新生血管以及血管網(wǎng)重建等，還可形成小的血管分支。基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡均具有直接作用，而TIMP1、TIMP2作為該家族的主要成員，不僅可參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖與凋亡的調(diào)控，還可影響新生血管生成，主要原因可能是影響細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶的降解。研究指出，新生血管生成是從基底膜降解開(kāi)始的，即鄰近血管生成刺激因子的靜脈基底膜降解，然后內(nèi)皮細(xì)胞變形，生成血管芽伸入細(xì)胞外基質(zhì)，與此同時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶增多，TIMP1減少，新生血管和基底膜生成，進(jìn)而參與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。另有報(bào)道顯示，膠質(zhì)瘤患者中細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶/TIMP平衡受損，TIMP1和TIMP2減少，其中TIMP1可直接參與新生血管生成，TIMP2不僅可與整合素α3β結(jié)合，還可誘導(dǎo)基因表達(dá)將細(xì)胞周期阻滯于G期，抑制細(xì)胞遷移，抑制新生血管生成。本研究中，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中TIMP1、TIMP2的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于周圍正常組織，MVD值明顯高于周圍正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Ⅳ級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中TIMP1、TIMP2的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于Ⅲ級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織，MVD值明顯高于Ⅲ級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說(shuō)明膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中TIMP1、TIMP2表達(dá)水平偏低，MVD值偏高，且惡性程度越高，上述指標(biāo)異常程度越嚴(yán)重。

MVD是新生血管生成的重要標(biāo)志，TIMP1和TIMP2的表達(dá)與神經(jīng)微絲陽(yáng)性的神經(jīng)元均具有緊密相關(guān)性，且二者均可影響神經(jīng)元由增生狀態(tài)向最終分化狀態(tài)轉(zhuǎn)化。因此TIMP1和TIMP2均可直接影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的新生血管生成潛能和惡性程度，惡性程度越高，MVD值越高，而TIMP1和TIMP2表達(dá)水平越低。國(guó)外報(bào)道指出，血管內(nèi)皮管腔的形成依賴于基質(zhì)金屬蛋白酶/TIMP平衡，各種因素加入后一旦打破二者的平衡關(guān)系，便可影響新生血管生成和腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移，使腫瘤組織的惡性潛能增加。既往報(bào)道顯示，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中TIMP1和TIMP2缺乏，基質(zhì)金屬蛋白酶高表達(dá)，前者可能與瘤周水腫無(wú)關(guān)，而后者與瘤周水腫密切相關(guān)。本研究結(jié)果與上述報(bào)道相符，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中TIMP1和TIMP2的表達(dá)均與MVD呈負(fù)相關(guān)，提示TIMP1和TIMP2表達(dá)水平越低，MVD值越高，新生血管生成越多，腫瘤的惡性程度越高。

綜上所述，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中TIMP1和TIMP2的表達(dá)水平均明顯低于周圍正常組織，MVD值均明顯高于周圍正常組織，且惡性程度越高，TIMP1和TIMP2的表達(dá)水平越低，MVD值越高，TIMP1和TIMP2的表達(dá)與MVD均呈負(fù)相關(guān)。結(jié)合本研究結(jié)果，建議嘗試將TIMP1和TIMP2作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤臨床治療的新靶點(diǎn)，以降低MVD值，抑制新生血管生成。如何采取有效的措施提高膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中TIMP1和TIMP2的表達(dá)水平，降低MVD值應(yīng)作為后期研究的重點(diǎn)。