miRNA-186上調Dicer1的表達影響胃癌細胞侵襲和遷移的作用機制研究

李道宏，胡愛俠，靳鈺煒

河南省人民醫院病理科，鄭州 450000

胃癌是常見的消化系統惡性腫瘤，全球范圍內，胃癌的發病率和病死率均較高，尤其高發于發展中國家。胃癌患者確診時常已經處于晚期，預后較差、生存率低，因此，提高胃癌的早期診斷率，早期治療，才能延長胃癌患者的生存期。眾所周知，遠處轉移是導致惡性腫瘤患者死亡的主要原因，但遠處轉移需多種蛋白、多種基因共同參與，且需經過多個步驟才能完成，而細胞增殖、遷移和侵襲是惡性腫瘤遠處轉移的主要特征。胃癌細胞具有較強的侵襲和遷移能力，可促使胃癌早期即發生轉移，或在轉移過程中發生進一步變化，導致化療失敗，并誘導胃癌復發或發生更深層的轉移。因此，明確胃癌細胞的侵襲、轉移機制有重要意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種單鏈小分子RNA，長度18～25 nt，在多種惡性腫瘤中發揮至關重要的作用，主要通過與靶蛋白結合調控細胞功能。腫瘤細胞的侵襲和遷移離不開上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、神經型鈣黏蛋白（N-cadherin）、Dicer1等的調控。研究表明，miRNA-186在食管癌中低表達，且生物信息學分析發現，miRNA-186可能靶向調控Dicer1，但其在胃癌中的作用機制鮮有相關報道，因此，本研究通過觀察miRNA-186在胃癌中作用機制，旨在為胃癌的早期診斷和靶向治療提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年3月至2019年6月河南省人民醫院收治的胃癌患者。納入標準：①經胃鏡和病理組織學檢查確診為胃癌；②未合并其他嚴重疾病。排除標準：①癌旁組織有明顯的炎性細胞浸潤；②合并胃潰瘍、胃糜爛；③合并其他惡性腫瘤。依據納入和排除標準，本研究共納入40例胃癌患者，其中男22例，女18例；平均年齡（61.35±5.65）歲；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期24例，Ⅲ～Ⅳ期16例；淋巴結轉移26例，無淋巴結轉移14例；分化程度：低分化28例，中高分化12例。取40例胃癌患者的胃癌組織及相應的癌旁正常組織。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞、主要試劑和儀器 胃癌細胞BGC-823、正常胃黏膜上皮細胞RGM-1、共轉染293FT細胞均購自中科院上海細胞研究所，pLVTHM-mimic-miRNA-186、pLVTHM-mimic-NC、miRNA-186及GAPDH引物均由上海吉瑪設計合成。Anti-Dicer抗體[4A6]（ab82539）、Anti-N-cadherin 抗體（ab76057）、山羊抗兔 IgG H&L（Alexa Fluor488）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗小鼠IgG H&L（ab205719）均購自美國Abcam公司，Transwell小室購自美國BD公司，Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Vector公司。SANYO MCO-15AC細胞培養箱購自美國強生公司，超凈工作臺購自北京六一儀器廠，5810R型高速離心機購自日本島津公司。

1.2.2 構建穩定過表達miRNA-186細胞系 取對數生長期的細胞，胰蛋白酶消化，調整細胞濃度至1×10/L，加入至6孔板中，置于37 ℃、5% CO的培養箱中培養，細胞融合度達70%時嚴格按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行轉染，分別將pLVTHM-mimic-miRNA-186和pLVTHM-mimic-NC轉染至293FT細胞，轉染48 h后收集慢病毒感染液，分別轉染BGC-823細胞，得到過表達的BGC-823-mimics-miRNA-186細胞、陰性對照BGC-823-mimics-NC細胞。

1.2.3 定量逆轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測組織和細胞中miRNA-186的相對表達量 取胃癌組織及癌旁正常組織，正常胃黏膜上皮細胞RGM-1、胃癌細胞BGC-823、BGC-823-mimics-miRNA-186及陰性對照BGC-823-mimics-NC細胞。Trizol法提取總RNA，逆轉錄成互補DNA（complementary DNA，cDNA），在PCR儀上進行擴增，擴增條件：95℃預變性30 s，1個循環；95℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環；95℃延伸5 s，60℃ 1 min，95℃終止，1個循環。以GAPDH作為內參，2計算miRNA-186的相對表達量。GAPDH正向引物：5'-TGCTCCTCCTCCTGCT-GCTC-3'，反向引物：5'-GCAGAAGGTGGAGGTGCAGC-3'；miRNA-186正向引物：5'-CTTCCAATACGTGCAGCAGA-3'，反向引物：5'-TCTTCAGGGCTTTCTCGTTC-3'。

1.2.4 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 取40 μl的Matrigel膠用不含胎牛血清的RPMI-1640以1∶8稀釋后，水化鋪在Transwell小室的上室底部，取胃癌細胞BGC-823、BGC-823-mimics-miRNA-186和BGC-823-mimics-NC細胞消化后，采用1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗 2次。同時，采用無血清的RPMI-1640培養液將細胞稀釋至1×10/ml，加入200 μl細胞懸液至 Transwell小室的上室，加入500 μmol含20% FBS的RPMI-1640至Transwell小室的下室，保證下層完全培養基與Transwell小室間無氣泡，置入培養箱培養24 h。取出Transwell小室的上室用預冷的PBS沖洗2次，加入500 μl甲醇配制、PBS稀釋的0.1%結晶紫染液進行染色，室溫避光15 min，PBS漂洗去掉Transwell小室內部游離細胞，倒置晾干，置于倒置熒光顯微鏡下觀察拍照并計數。

1.2.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取胃癌細胞BGC-823、BGC-823-mimics-miRNA-186和 BGC-823-mimics-NC細胞消化后，采用無血清培養基調整細胞濃度為5×10/ml，加入至6孔板中，置于37℃、5% CO的培養箱中培養，待細胞融合度達90%時，采用10 μl白色槍頭垂直劃線，PBS沖洗，顯微鏡下拍照記為0 h，加入培養基繼續溫箱培養48 h拍照，然后計算細胞遷移率。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因驗證miRNA-186和

Dicer1

的關系 從PCR擴增http://www.targetscan.org網站得到miRNA-186和

Dicer1

的靶向結合片段，然后將其插入熒光素酶載體psi-CHECK中，構建野生型質粒psi-CHECK-Dicer1-wild和突變型質粒 psi-CHECK-Dicer1-mutant，以 mimics-NC 為 對照。然后將野生型和突變型質粒分別共轉染至293FT細胞，4 h后采用分光光度計檢測熒光素酶活性（OD）。

1.2.8 蛋白質印跡法（Western blot）檢測Dicer1蛋白的相對表達量 取正常胃黏膜上皮細胞RGM-1、胃癌細胞 BGC-823、BGC-823-mimics-miRNA-186和BGC-823-mimics-NC細胞，胰蛋白酶消化，離心稀釋成細胞懸液，按1×10/孔接種至6孔板中；置入5% CO、37℃培養箱3 h，采用試劑盒提取各組細胞總蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白含量。每個樣本取50 μg蛋白上樣，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠電泳后，轉至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入稀釋好的一抗，4℃孵育過夜。恢復至室溫后，PBST充分洗膜，加入適量稀釋好的HRP標記的二抗，室溫振蕩1 h，PBST洗膜，電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）法顯色，采用Image J軟件分析條帶的灰度值，以GAPDH作為內參，計算Dicer1的相對表達量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 miRNA-186相對表達量的比較

胃癌組織中miRNA-186的相對表達量為（0.26±0.01），明顯低于癌旁組織的（1.07±0.14），差異有統計學意義（

t

=36.932，

P

＜0.01）。胃癌細胞BGC-823和BGC-823-mimics-NC中miRNA-186的相對表達量均明顯低于正常胃黏膜上皮細胞RGM-1，穩定過表達BGC-823-mimics-miRNA-186細胞中miRNA-186的相對表達量明顯高于胃癌細胞BGC-823、BGC-823-mimics-NC和正常胃黏膜上皮細胞RGM-1，差異均有統計學意義（

P

＜0.01）（表1）。

表1 不同細胞中miRNA-186相對表達量的比較（±s）

2.2 miRNA-186對胃癌細胞BGC-823侵襲和遷移能力的影響

Transwell實驗結果顯示，BGC-823-mimicsmiRNA-186細胞侵襲數目少于胃癌細胞BGC-823和BGC-823-mimics-NC，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。細胞劃痕實驗結果顯示，BGC-823-mimicsmiRNA-186細胞遷移率低于胃癌細胞BGC-823和BGC-823-mimics-NC，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。（表 2）

表2 miRNA-186對胃癌細胞BGC-823侵襲和遷移能力的影響（±s）

2.3 miRNA-186對N-cadherin的影響

過表達miRNA-186的BGC-823-mimics-miRNA-186細胞中N-cadherin陽性表達率低于胃癌細胞BGC-823和BGC-823-mimics-NC，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。（表3）

表3 不同細胞N-cadherin表達情況的比較（%，±s）

2.4 miRNA-186對Dicer1的影響

雙熒光素酶報告結果顯示，mimics-miRNA-186能明顯抑制野生型psi-CHECK-Dicer1-wild的熒光素酶活性，差異有統計學意義（

P

＜0.05）；而對突變型psi-CHECK-Dicer1-mutant的熒光素酶活性無明顯影響，差異無統計學意義（

P

＞0.05）。（表4）

表4 miRNA-186對野生型和突變型Dicer1熒光素酶活性的影響（±s）

2.5 Dicer1蛋白相對表達量的比較

Western blot結果顯示，胃癌細胞BGC-823和BGC-823-mimics-NC中Dicer1蛋白的相對表達量均明顯低于正常胃黏膜上皮細胞RGM-1，且BGC-823-mimics-miRNA-186細胞中Dicer1的相對表達量高于胃癌細胞BGC-823和BGC-823-mimics-NC，差異均有統計學意義（

P

＜0.01）。（表5）

表5 不同細胞Dicer1蛋白相對表達量的比較（±s）

3 討論

胃癌是常見的消化系統惡性腫瘤，全球范圍內，胃癌病死率居所有惡性腫瘤的第三位。因胃癌的局部復發或遠處轉移導致病死患者逐年上升。中國是胃癌高發國家，嚴重威脅中國居民的身體健康及生活質量。胃癌的發病機制十分復雜，盡管目前的外科手術和化療手段不斷進步，但胃癌的病死率仍居高不下，患者的5年生存率遠遠低于30%。胃癌細胞的遠處轉移成為影響胃癌患者治療成功的關鍵。因此，探討與胃癌發生發展相關的分子及作用機制在胃癌的診斷和治療中有重要意義。miRNA主要通過競爭或靶向調節信使RNA（messenger RNA，mRNA）發揮作用，能參與細胞的增殖、分化和凋亡等過程。近年來，多種實體腫瘤中均發現了miRNA的異常表達，且能夠通過調控癌基因來調節腫瘤細胞的生物學特性。miRNA-186作為miRNA成員，共有86個核苷酸，位于染色體lp31.1上，有研究發現，miRNA-186可靶向下調子宮內膜癌抑癌基因叉頭框蛋白O1（forkhead box O1，FOXO1）的表達，從而促進腫瘤細胞的增殖；還有研究顯示，miRNA-186在腫瘤上皮細胞能夠下降凋亡蛋白P2X7的表達來發揮促癌作用；但也有學者研究發現，miRNA-186在原發性神經管細胞瘤中表達下調，可能發揮抑癌基因的作用；此外，研究發現，miRNA-186可抑制非小細胞肺癌細胞的增殖，同時抑制細胞中細胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclin dependent kinase 2，CDK2）、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）等蛋白的表達。

本研究采用qRT-PCR法檢測組織和細胞中miRNA-186的相對表達量，結果顯示，胃癌組織和胃癌細胞中miRNA-186均表達下調，隨后采用慢病毒轉讓技術構建穩定過表達miRNA-186的細胞系，從而觀察其在胃癌中的作用機制。侵襲和遷移能力是腫瘤細胞的重要生物學行為，也是患者發生遠處轉移甚至死亡的根本原因。本研究結果顯示，BGC-823-mimics-miRNA-186細胞侵襲數目較少、遷移率較低，表明miRNA-186能抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移。侵襲和遷移是惡性腫瘤的基本生物學特征，涉及多種蛋白因子相互協調和共同作用，EMT是實體腫瘤發生侵襲和遷移的重要進程，可能是因為EMT主要是腫瘤細胞從腫瘤母體脫離并向周圍組織轉移擴散的起始。作為EMT的標志物，研究表明，N-cadherin在鼻咽癌中表達明顯上調。本研究經IFA觀察發現，過表達miRNA-186的BGC-823-mimics-miRNA-186細胞中N-cadherin陽性表達率低于胃癌細胞BGC-823和BGC-823-mimics-NC，提示miRNA-186能夠抑制N-cadherin的表達。研究發現，肝癌細胞中Dicer1呈低表達，其主要受到miRNA-215的調控，從而促進肝癌細胞侵襲和轉移；還有學者在漿液性卵巢癌動物模型中發現，Dicer1能夠明顯抑制卵巢癌的發生發展過程，且其水平高低與卵巢癌的進展呈明顯負相關；本研究雙熒光素酶報告實驗證實，miRNA-186能夠靶向調控Dicer1；此外，Western blot實驗發現，過表達miRNA-186后，Dicer1表達明顯上調，提示miRNA-186可正向調控Dicer1。

綜上所述，miRNA-186通過靶向正調控Dicer1的表達，下調N-cadherin的表達，從而發揮抑制胃癌細胞侵襲和遷移的作用，但仍需進一步采用慢病毒轉染技術調控Dicer1的表達，觀察Dicer1與EMT的關系。