奧利司他對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝的保護(hù)作用及機(jī)制研究

姚瑞強(qiáng)

（山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院，山西 汾陽(yáng) 032200）

肝臟脂肪含量被認(rèn)為是糖尿病、心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，減少肝臟脂肪沉積可減少肝細(xì)胞凋亡、壞死及炎癥反應(yīng)，非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是無(wú)過(guò)量飲酒史人群以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性及脂肪儲(chǔ)積為特征的病理綜合征，包括非酒精性肝脂肪變性（Non-alcholic fatty liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH）、肝硬化及肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）[1-2]。磷脂酰肌醇-3激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）具有脂類(lèi)激酶及蛋白激酶活性，PI3K家族作為機(jī)體生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)中一類(lèi)重要因子，可被多種細(xì)胞因子及理化因素激活，并催化磷脂酰肌醇，使其羧基端發(fā)生磷酸化，繼而出現(xiàn)有信使作用的肌醇類(lèi)激酶，蛋白激酶B（Protein kinase B，AKT）是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為PI3K/AKT信號(hào)通路的主要下游分子，在各種信號(hào)級(jí)聯(lián)中充當(dāng)PI3K下游的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物，該信號(hào)通路有促凋亡、增殖、分泌、趨化等作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT通路的抑制可導(dǎo)致胰島素抵抗（Insulin resistance，IR），繼而促進(jìn)NAFLD的進(jìn)展[4]。奧利司他作為非中樞性減重藥物，可與胃、胰脂肪酶的絲氨酸殘基結(jié)合，使脂肪酶失去活性，導(dǎo)致食物中的脂肪不能被分解為游離脂肪酸（Free fatty acid，F(xiàn)FA），抑制脂肪利用及吸收。早期有研究發(fā)現(xiàn)，奧利司他可作為治療藥物來(lái)改善肝臟損傷性生化指標(biāo)，但非首選藥，可作為姑息治療選擇[5]。Esmail等人最新研究發(fā)現(xiàn)，短期奧利司他療法可改善NAFLD和代謝綜合征患者脂肪浸潤(rùn)指數(shù)、肝纖維化評(píng)分[6]，然而目前關(guān)于奧利司他對(duì)NAFLD的作用機(jī)制研究甚少。本文主要分析奧利司他對(duì)NAFLD模型大鼠的保護(hù)作用及PI3K/AKT信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康清潔級(jí)6～8周雄性SD大鼠（165~190 g）30只，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.2 主要儀器與試劑

BS-0220生化分析儀（深圳邁瑞），UV-2550分光光度計(jì)（日本津島）；電泳儀（美國(guó)BIO-RAD），凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD）。高脂飼料，上海斯萊克；甘油三酯（Triglyceride，TG）、空腹血糖（Fiber bragg grating，F(xiàn)BG）、空腹胰島素（Fasting serum lisulin，F(xiàn)INS）測(cè)定試劑盒均購(gòu)自北京中生北控生物科技；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（γ-Glutamyltransferase，GGT）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase，AST）測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白定量分析試劑盒（Thermo Fisher公司）；PI3K和AKT一抗購(gòu)自Thermo公司。

1.3 動(dòng)物分組與處理

所有大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，以普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，開(kāi)始對(duì)大鼠進(jìn)行為期8周的NAFLD模型構(gòu)建。對(duì)照組繼續(xù)喂食普通飼料，模型組改喂食高脂飼料，奧利司他組在模型組飼養(yǎng)基礎(chǔ)上灌胃奧利司他（規(guī)格：60 mg，湖南明瑞制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20183303）60 mg·（kg·d）-1。記錄每日攝食量。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前12 h開(kāi)始禁食，自由飲水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱量大鼠增長(zhǎng)體質(zhì)量。

1.4 血糖代謝水平測(cè)定

禁食10 h后進(jìn)行葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)，取大鼠尾靜脈血分離血清，測(cè)定FBG。同時(shí)按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定腹主動(dòng)脈血清FINS，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)（Insulin sensitivity index，ISI），ISI=l/（空腹血糖×空腹胰島素）。

1.5 肝臟脂質(zhì)及血清生化指標(biāo)測(cè)定

禁食12 h后乙醚麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，取肝臟、肌肉等臟器組織稱重。每只大鼠準(zhǔn)確稱取20 mg肝臟，制作肝臟勻漿，依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定TG。勻漿經(jīng)室溫靜置30 min后3000 rpm離心10 min分離血清，測(cè)定AST、GGT、ALT。

1.6 組織學(xué)檢測(cè)

取新鮮肝組織，以O(shè)CT包埋劑包埋，甲醛鈣固定，60%異丙醇清洗，油紅O染色液染色，60%異丙醇洗浮色，蒸餾水水洗，蘇木精復(fù)染核，蒸餾水洗，晾干后封片觀察、攝片。

1.7 肝組織蛋白檢測(cè)

采用Western blot法測(cè)定肝組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平。取適量肌組織加RIPA裂解液，提取蛋白，以BCA試劑盒測(cè)定其濃度。采用SDSPAGE電泳進(jìn)行分裂，轉(zhuǎn)膜，BSA封閉。加一抗及經(jīng)HRP標(biāo)記的二抗孵育，加化學(xué)發(fā)光試劑顯色，拍照并統(tǒng)計(jì)灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)處理

應(yīng)用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 攝食量、體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量比較

攝食期間三組攝食量、增長(zhǎng)體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），模型組、奧利司他組肝臟質(zhì)量高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 肝組織油紅O染色結(jié)果

對(duì)照組肝細(xì)胞胞漿、胞核呈藍(lán)色，無(wú)明顯橘紅色脂滴，模型組肝細(xì)胞胞漿中可發(fā)現(xiàn)許多大小不等橘紅色脂滴，且呈彌漫性分布，提示造模成功，奧利司他組肝細(xì)胞脂滴較模型組縮小且減少，染色變淺，但仍較對(duì)照組深。見(jiàn)圖1。

表1 三組攝食量、增長(zhǎng)體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量比較（±SD，n=10）

表1 三組攝食量、增長(zhǎng)體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量比較（±SD，n=10）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

組別 攝食量（g·d-1） 增長(zhǎng)體質(zhì)量（g） 肝臟質(zhì)量（g） 對(duì)照組 19.18±2.03 56.82±5.86 14.21±1.58 模型組 21.22±2.25 60.44±6.18 22.03±2.54* 奧利司他組 21.36±2.35 60.72±6.13 22.75±2.38*

圖1 各組大鼠肝組織油紅O染色結(jié)果（×200）

2.3 肝組織脂質(zhì)含量與肝功能酶學(xué)指標(biāo)比較

模型組TG、ALT、GGT、AST明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），奧利司他組TG、ALT、GGT、AST明顯低于模型組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 三組血糖代謝指標(biāo)比較

模型組FBG、FINS高于對(duì)照組（P＜0.05），ISI明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），奧利司他組FBG、FINS明顯低于模型組（P＜0.05），ISI明顯高于模型組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.5 三組PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平比較

與對(duì)照組相比，模型組肝組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平更低，而奧利司他組的肝組織中PI3K、AKT蛋白的表達(dá)水平高于模型組（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

表2 三組脂質(zhì)含量與肝功能酶學(xué)指標(biāo)比較（±SD，n=10）

表2 三組脂質(zhì)含量與肝功能酶學(xué)指標(biāo)比較（±SD，n=10）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別 TG（mg·g-1） ALT（IU·g-1） GGT（IU·g-1） AST（IU·g-1） 對(duì)照組 10.15±1.16 10.54±1.27 56.43±5.57 3.97±0.45 模型組 123.41±14.58* 28.67±2.93* 70.19±7.18* 15.13±1.62* 奧利司他組 71.89±7.26*# 18.23±1.85*# 62.35±6.37*# 13.11±1.89*#

表3 三組血糖代謝指標(biāo)比較（±SD，n=10）

表3 三組血糖代謝指標(biāo)比較（±SD，n=10）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別 FBG（mmol·L-1） FINS（μg·L-1） ISI 對(duì)照組 5.43±0.57 0.10±0.02 -2.35±0.26 模型組 6.54±0.68* 0.21±0.04* -3.18±0.34* 奧利司他組 5.21±0.54# 0.16±0.02*# -2.63±0.29#

圖2 三組PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

NAFLD是由代謝應(yīng)激誘導(dǎo)的肝損傷性疾病[7-8]。NAFLD的病因主要是IR及其代謝紊亂構(gòu)成脂肪浸潤(rùn)肝臟首次打擊，而肝臟脂質(zhì)沉積也是其最大特點(diǎn)，因此改善脂質(zhì)及胰島素代謝是該病的治療重點(diǎn)[9]。奧利司他是非作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物[10]，對(duì)NAFLD有改善作用，但奧利司他對(duì)NAFLD的治療效果與機(jī)制研究甚少。PI3K/AKT為對(duì)細(xì)胞增殖、分化、凋亡及衰老進(jìn)行調(diào)節(jié)的關(guān)鍵信號(hào)通路，與細(xì)胞增殖、凋亡之間存在密切關(guān)系[11]，關(guān)于NAFLD發(fā)展與PI3K/AKT信號(hào)通路的關(guān)系目前已有研究[12]，而奧利司他是否通過(guò)影響該信號(hào)通路對(duì)NAFLD發(fā)揮肝保護(hù)作用目前未見(jiàn)研究。

本研究發(fā)現(xiàn)奧利司他組大鼠肝細(xì)胞脂滴較模型組縮小且減少，染色變淺，但仍較對(duì)照組深，提示高脂飲食導(dǎo)致大量肝臟脂肪細(xì)胞沉積，而奧利司他可有效減少肝臟脂肪細(xì)胞浸潤(rùn)，延緩NAFLD進(jìn)展[13-14]。

IR及高胰島素血癥共同作用導(dǎo)致肝臟內(nèi)FFA及TG增多，大量FFA進(jìn)入血液，使細(xì)胞色素酶P450ⅡE1（Recombinant cytochrome P450 2E1，CYP2E1）表達(dá)增多，造成氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）過(guò)量生成，多次平行撞擊使氧化應(yīng)激增加，脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，引起炎癥細(xì)胞聚集，使肝臟由炎癥、NAFL到NASH及纖維化進(jìn)展，從而起著雙重作用，影響NAFLD發(fā)病進(jìn)程。本研究對(duì)三組脂質(zhì)含量及肝功能酶學(xué)指標(biāo)的觀察發(fā)現(xiàn)，奧利司他能較好減輕NAFLD的脂質(zhì)代謝水平，改善其肝功能。奧利司他為非中樞性減重藥，可選擇性與腸道脂肪酶活性絲氨酸殘基共價(jià)結(jié)合而使酶失去活性，繼而抑制TG水解，使TG及FFA攝入減少，體內(nèi)原有脂肪分解供能，達(dá)到控制體重、改善高血糖、高血脂的作用[15]，這也是奧利司他組糖代謝水平優(yōu)于模型組的原因。

PI3K/AKT通路為胰島素信息進(jìn)行傳導(dǎo)主要通路，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及蛋白質(zhì)形成、代謝等生物學(xué)過(guò)程[16-17]。AKT為PI3K/AKT信號(hào)通路中心環(huán)節(jié)[18-19]，為PI3K信號(hào)傳導(dǎo)重要的下游靶激酶[20]。本次模型組肝組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，奧利司他組肝組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平高于模型組，表明奧利司他可通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路而發(fā)揮對(duì)NAFLD的肝保護(hù)作用。PI3K可使其下游靶蛋白AKT磷酸化，形成p-AKT，p-AKT進(jìn)一步使糖原合成酶激酶-3β磷酸化、失去活性，繼而喪失誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，此外p-AKT也能抑制促凋亡蛋白caspase、Bad及Bax合成，從而抑制細(xì)胞凋亡，當(dāng)PI3K/AKT信號(hào)通路被激活后可促進(jìn)細(xì)胞增殖，相反該信號(hào)通路被抑制則可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，應(yīng)用奧利司他后PI3K/AKT信號(hào)通路可調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路，介導(dǎo)胰島素抵抗及細(xì)胞增殖、周期調(diào)節(jié)等，從而起到肝保護(hù)作用[21]。

綜上所述，奧利司他可通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路而保護(hù)NAFLD模型大鼠的肝功能，從而改善肝臟脂質(zhì)含量、肝功能酶學(xué)指標(biāo)以及血糖水平。