冷甲醇固定時間與不同組織冷凍切片染色質量的相關性分析

王巖 梁靜

（河南科技大學第一附屬醫院病理科，河南 洛陽 471003）

冷凍切片是將術間組織冷凍至硬塊并將其切片，并作為診斷依據的有效方法。因其制作方便、快捷，故多用于術間病理診斷[1-2]。然而，診斷進程受切片制作時長及染色效果影響，如固定液選擇種類、染色劑設備、固定時長等[3-4]。目前，無水乙醇、95%乙醇、冷甲醇、無水乙醇乙醚混合液是臨床常見冷凍液，其中冷甲醇是相關報道中最受認可的固定液，其固定效果較為理想，且染色結果穩定可靠，便于操作。但臨床對冷甲醇的固定時間尚無定論，且冷甲醇用于不同組織冷凍切片染色質量的研究也相對少見。本研究擬分析冷甲醇固定時間與不同至組織冷凍切片染色質量關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

抽取2018年5月至2020年5月我院病理科獲得明確石蠟切片病理診斷結果的119例冷凍標本，其中乳腺結節45例、卵巢腫物41例、甲狀腺腫物19例、肺部結節14例。根據冷甲醇固定時間分為A組（40s）、B組（60s）、C組（80s），A組（n＝39例）：乳腺結節、卵巢腫物、甲狀腺腫物、肺部節結分別為14例、6例、5例、14例；B組（n＝39）：乳腺結節、卵巢腫物、甲狀腺腫物、肺部節結分別為15例、7例、5例、12例；C組（n＝41）：乳腺結節、卵巢腫物、甲狀腺腫物、肺部節結分別為16例、6例、4例、15例，三組冷凍標本比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究符合2013 年修訂的《赫爾辛基宣言》的要求。

1.2 方法

制片：放置冷甲醇固定液于冷凍機（品牌：深圳安億達有限公司；型號：AYD-05A）內進行預冷，制冷溫度為-10℃~50℃，同時將術間取下組織速凍，使用美國櫻花OCT冷凍切片包埋劑（品牌：美國櫻花SAKURA；貨號：4583；產品規格：118 ml/支），使用期間要清楚包埋劑所生成的氣泡。待組織物變硬后，使用切片機（英國Campden Instruments，型號：7000 smz /5100 mz）切片，設置厚度為6～77 μm，連切5張，按A、B、C組冷甲醇固定時間實施，水洗；蘇木素染色時間為50 s，使用自來水清洗，碳酸鉀水溶液（0.05%）于15 s后返藍，伊紅（1%）20 s，梯度酒精脫水，二甲苯I、II均15 s透明，最后選擇中性樹膠進行封片。

1.3 觀察指標

1.3.1 比較三組不同冷凍標本的染色情況

選擇我科讀片經驗≥5年醫師，根據石蠟切片評定標準[5]，評估全部冷凍切片，并給予評分。0分：無法區分細胞形態，細胞核膜模糊，核質難以對比，且染色質較為松散；1分：細胞形態及其內部結構均較為完整，細胞核膜、核質染色達到區別標準；2分：細胞形態及其內部結構、核膜均完整、清晰，核質染色區分顯著，但染色質未明顯收縮。

1.3.2 比較三組不同冷凍標本的病理分型診斷結果

以石蠟切片病理診斷結果為診斷金標準進行比較。

1.4 統計學分析

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±SD）表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組不同冷凍標本的染色情況

將石蠟切片作為對照組。B、C冷凍標本質量優于A組，差異有統計學意義（P＜0.05），詳見表1。

表1 三組不同冷凍標本的染色情況（±SD，分）

表1 三組不同冷凍標本的染色情況（±SD，分）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與A組相比，aP＜0.05。

組別 乳腺結節 卵巢腫物 甲狀腺腫物 肺部節結 A組（n＝39） 0.11±0.01* 1.33±0.14* 0.22±0.01* 0.20±0.02* B組（n＝39） 1.54±0.15a 1.53±0.20 1.47±0.12a 1.52±0.20a C組（n＝41） 1.61±0.10a 1.46±0.18 1.55±0.15a 1.46±0.18a 對照組（n=119） 1.58±1.13 1.50±0.19 1.51±0.13 1.49±0.19

2.2 三組不同冷凍標本的病理分型

以石蠟切片病理診斷結果為診斷金標準，A組、B組、C組乳腺結節病理分型診斷準確率分別為85.71%（12/14）、93.33%（14/15）、100.00%（16/16）；卵巢腫物病理分型診斷準確率分別為66.67%（4/6）、71.43%（5/7）、83.33%（5/6）；肺部節結節病理分型診斷準確率分別為85.71%（12/14）、91.67%（11/12）、86.67%（13/15）。三組不同冷凍標本病理分型診斷準確率比較無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

本研究B、C冷凍標本質量優于A組，說明乳腺結節、卵巢腫物、甲狀腺腫物、肺部節結使用冷甲醇固定液時，不同時間所呈現的染色質量不一，其中冷甲醇固定時間為60 s、80 s時，不同組織冷凍切片染色質量均較優。石蠟切片能準確定位組織細胞，長期保存標本，維持較好組織細胞形態，但保真性較差，易在組織固定、脫水、透明等環節中影響抗原性質，且操作步驟比石蠟切片更為繁瑣。冷凍切片對抗原保真顯著，且染色過程簡單，適合新鮮組織制片，且固定、染色效果均較佳，多應用于手術中的快速病理診斷[3-4]。此外，B、C組冷凍標本在達到最佳制片情況下有效檢出冷凍標本的不同病理分型，說明若冷凍切片質量達標，同一病理組織使用同一固定液后，其病理分型固定時間基本接近。同時，本研究以石蠟切片病理診斷結果為診斷金標準，A組、B組、C組乳腺結節、卵巢腫物及肺部節結節病理分型診斷準確率均高于75%，三組不同冷凍標本病理分型診斷準確率比較無顯著差異，可能與本研究標本數量尤其是不同病理分型冷凍標本數量較少有關。此外，切片質量還與其他環節有關，如切片固定后使用冷風干燥可降低脫片概率。但也有與之相反結論，認為無論冷風或熱風均無法降低脫片概率，且冷熱風有損切片染色質量，尤其是淋巴組織[5]。因此，本研究認為，冷甲醇固定時間為60s、80s時，不同組織冷凍切片染色質量均較優，但其對最終診斷結果的影響不顯著。而最佳冷凍切片需要探索固定時間、液體、材料等諸多環節，尋找最佳組織并將其合力，才能為臨床診斷提供較好依據。