WDR5在肺腺癌中的表達和預后提示作用研究

孫平 徐俊

肺癌是目前全球發(fā)病率最高的癌癥之一，也是全球癌因性死亡的首要原因之一[1]。據(jù)文獻報道，每年的新增肺癌病例數(shù)正在不斷增加[2]。通常臨床上將肺癌分為小細胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）和非小細胞型肺癌（non small cell lung cancer,NSCLC）兩大類，其中NSCLC約占所有肺癌的75%～85%[3]。NSCLC主要包括腺癌、鱗癌、大細胞肺癌等組織學類型。近年來，腺癌的比例逐漸增多并超過了鱗癌成為最常見的肺癌組織類型，約占所有肺癌的40%[1]。肺腺癌的預后較差，全球每年因肺腺癌病死的患者數(shù)超過50萬例[4]。WD 重復域蛋白5（WD repeat-containingprotein 5,WDR5）是WD-40蛋白家族的主要成員[5]，參與各種細胞生理過程[6]。近年來有多項研究著眼于WDR5基因在腫瘤細胞中的作用，并取得了不小的進展。如有研究發(fā)現(xiàn)在低氧刺激的腫瘤微環(huán)境乳腺癌細胞模型中，WDR5可誘導上皮-間充質轉化的發(fā)生[7]。另外，WDR5還在胃癌、結直腸癌、白血病、前列腺癌等[8-11]多種腫瘤中通過多種途徑發(fā)揮作用。目前，國內外尚鮮見涉及肺腺癌組織中WDR5表達及其臨床意義的相關實驗研究。因此本研究通過免疫組化方法檢測肺腺癌及癌旁組織中的WDR5的表達，分析WDR5表達與肺腺癌發(fā)生、發(fā)展的關系，探討WDR5表達水平對患者預后評估的價值。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2010年1月1日至2014年2月8日于杭州市第三人民醫(yī)院胸外科就診且術后病理檢查結果證實為肺腺癌的患者93例，其中男41例，女52例，年齡 20～84（60.5±10.7）歲，60歲及以上 50 例，60歲以下43例。所有患者術前均未接受放療或化療。本研究經本院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

腫瘤分期依據(jù)AJCC第七版臨床分期。癌旁正常組織標準：距腫瘤邊緣＞2 cm，且病理結果為正常組織。手術切除肺腺癌組織標本經10%中性甲醛溶液固定后送病理科，連續(xù)石蠟切片后行HE染色，所有病理切片均經至少2位病理醫(yī)師分別確診。病理分級根據(jù)UICC 2010年第七版肺癌病理分期標準。

1.2 主要試劑及儀器 兔抗人WDR5單克隆抗體購自英國Abcam公司；EnvisionTM試劑盒以及二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽（DAB）顯色試劑盒均購自丹麥DAKO公司；超薄石蠟切片機以及病理組織烘漂處理儀購自德國Leica公司；光學顯微鏡（型號：BX41）以及病理大體標本成像系統(tǒng)均購自日本OLYMPUS公司。

1.3 實驗方法 選取所有患者肺腺癌及其對應癌旁正常組織石蠟塊進行免疫組織化學染色（EnVision法），以抗體稀釋液替代WDR5抗體作為空白對照，以乳腺癌組織切片作為陽性對照。

1.4 免疫組化陽性結果判定標準 肺腺癌及其癌旁正常組織WDR5染色陽性表現(xiàn)為鏡下腫瘤細胞胞質和細胞核出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。首先在100倍光鏡下挑選實質腫瘤區(qū)域，然后在200倍光鏡下隨機挑選5個視野并拍照。根據(jù)染色強度進行評分：陰性=0，弱陽性=1，中等陽性=2，強陽性=3。陽性染色細胞數(shù)分級為：＜10%（陰性=0），10%～＜30%（弱陽性=1），30%～＜50%（中等陽性=2），≥50%（強陽性=3）。計算每個視野的得分之和，取其平均值作為WDR5的相對表達水平：≥3時判定為WDR5相對高表達，＜3時判定為WDR5低表達。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Cox比例風險回歸模型對患者的生存情況作單因素、多因素分析，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用log-rank檢驗比較WDR5高表達與低表達患者1、3及5年生存率。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺腺癌組織和癌旁正常肺組織中WDR5的表達水平比較 53例（57.0%）患者肺腺癌組織中WDR5相對高表達，40例（43.0%）WDR5相對低表達；30例（32.3%）癌旁正常組織中WDR5相對高表達，63例（67.7%）WDR5相對低表達，與癌組織比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1（插頁）。此外，WDR5相對高表達的30例癌旁正常組織相對應的癌組織全部呈WDR5相對高表達。

圖1 肺腺癌組織和癌旁正常肺組織中WD重復域蛋白5（WDR5）的表達情況（a：癌旁正常組織WDR5相對低表達，×200；b：肺腺癌組織WDR5相對低表達，×200；c：肺腺癌組織WDR5相對高表達，×200；免疫組化染色）

2.2 WDR5在肺腺癌組織中的表達與臨床特征的關系 肺腺癌組織中WDR5的表達與患者的性別、年齡、腫瘤直徑、T分期、病理分級均無關（均P＞0.05）；但與N分期和腫瘤分期均相關（均P＜0.01）。在WDR5相對高表達組（53例）中，淋巴結轉移陽性35例、陰性18例，Ⅰ/Ⅱ期43例、Ⅲ/Ⅳ期10例；而WDR5相對低表達組（40例）中，淋巴結轉移陽性14例、陰性26例，Ⅰ/Ⅱ期19例、Ⅲ/Ⅳ期21例；兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見表1。

表1 WDR5在肺腺癌組織中的表達與臨床特征的關系[例（%）]

2.3 肺腺癌預后影響因素分析 單因素分析結果顯示，WDR5表達、N分期和腫瘤分期均是肺腺癌患者預后的影響因素（均P＜0.01），見表2。進一步多因素分析結果顯示，WDR5表達和N分期是肺腺癌患者預后的獨立影響因素（均P＜0.01），見表3。

表2 肺腺癌預后影響因素的單因素分析

表3 肺腺癌預后影響因素的多因素分析

2.4 肺腺癌組織中WDR5的表達與預后的關系 本組患者中有3例生存時間僅為2個月，其中1例肺腺癌組織中WDR5相對高表達，余2例WDR5相對低表達。53例WDR5相對高表達患者的平均1年生存率為86.8%，3年生存率為41.5%，5年生存率為9.4%；40例WDR5相對低表達患者的平均1年生存率為95.0%，3年生存率為80.0%，5年生存率為55.0%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖2。上述結果提示WDR5的表達與肺腺癌患者的預后相關。

圖2 肺腺癌組織中WD重復域蛋白5（WDR5）高表達與低表達患者的生存曲線

3 討論

我國肺癌的發(fā)病率和死亡率均居所有惡性腫瘤前列[12]，其中肺腺癌約占所有肺癌的40%[13]。盡管新的治療手段及藥物在不斷的提出并應用，但肺癌的死亡率仍然沒有明顯改善[1]。大部分肺癌患者診斷時就已經處于中晚期[14]，其中NSCLC初次確診患者中ⅢA期占16%，ⅢB期占 8%，Ⅳ期患者占 41%[2，15]。因此，探索肺癌進展的分子機制，對改善肺癌預后至關重要。

WDR5是人組蛋白甲基轉移酶（mixed lineage leukaemia,MLL）1～4組蛋白第三亞基四號賴氨酸甲基轉移酶復合物的核心亞基[16]，在惡性腫瘤中扮演了重要角色。在促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展方面，WDR5可以將MLL募集到增強子上并調節(jié)其活性，導致白血病基因和白血病的激活[17]。WDR5通過維持腫瘤細胞的DNA復制，促進胰腺導管腺癌的細胞增殖以及腫瘤發(fā)展[18]。WDR5在人類前列腺癌組織中過度表達，其不僅誘導前列腺癌細胞的增殖，并且能驅動前列腺癌細胞發(fā)展出去勢抗性[19]。在促進腫瘤轉移方面，WDR5可誘導乳腺癌細胞表皮-間充質轉換現(xiàn)象的發(fā)生[7]。另外，WDR5可以上調淋巴管生成因子的表達，從而導致膀胱癌組織內淋巴管生成以及淋巴結轉移[20]。然而，WDR5基因在肺癌內的研究正處于初始階段，這將是肺癌基礎研究的一個重要方向。

本研究主要涉及的是WDR5基因在肺腺癌內的表達特征以及其與肺癌臨床病例特征和預后間的相關性研究，這是研究WDR5基因在肺癌發(fā)生、發(fā)展中作用的初步探索。本研究顯示，WDR5在肺腺癌組織中的表達水平高于癌旁正常肺組織。WDR5高表達與更高的N分期、腫瘤分期相關。但WDR5的表達與性別、年齡、T分期、病理分級和腫瘤直徑無相關性。提示WDR5在肺腺癌中扮演了促癌基因的角色，其通過促進肺腺癌的淋巴結轉移來促進肺腺癌的生物學進展。此外，Cox單因素和多因素分析結果均表明WDR5高表達與更差的預后相關，提示WDR5是肺腺癌的獨立危險因子，進一步研究WDR5如何促進肺腺癌進展意義巨大。生存分析的結果同樣表明，相較于低表達WDR5基因的肺腺癌患者來說，WDR5基因表達較高的患者通常擁有更差的預后。

綜上所述，WDR5在肺腺癌中的表達明顯升高，并與淋巴轉移及更差的預后相關，提示WDR5基因可能通過促進肺腺癌轉移來參與腫瘤進展，是肺腺癌可靠的預后指標以及潛在的治療靶點。