ZNF667-AS1在結直腸癌組織中的表達及其對細胞增殖的影響

吳莉萍 高學仁 王建國

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種嚴重威脅人類健康的消化系統惡性腫瘤，其全球發病率居高不下且存在明顯的地域差異[1-2]。我國屬于CRC低發國家，但是近年來隨著社會經濟的發展、人口老齡化以及生活方式的改變，CRC發病率呈明顯上升趨勢[3]。目前雖然學者們對CRC的診斷、治療及發病機制等做了大量研究工作，但由于CRC具有發現晚、侵襲性強、致病機制復雜等特性[4]，亟需探討其診斷標志物及分子致病機制，從而為早發現、早診斷、早治療提供新的思路。ZNF667-AS1屬于鋅指蛋白667反義鏈RNA，作為一種長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）參與多種細胞的生物學過程，進而影響疾病的發生、發展[5]。ZNF667-AS1最早在乳腺上皮細胞中被發現，其在多種惡性腫瘤中呈低表達[6]。目前關于ZNF667-AS1的研究報道較少，在CRC中的生物學功能也尚不清楚，故本研究檢測了ZNF667-AS1在CRC組織和細胞系中的表達，并結合細胞生物學實驗探討ZNF667-AS1在CRC發生、發展中的作用機制，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 標本cDNA來源 CRC組織及癌旁（距離癌組織5 cm處）正常組織標本來自2017年3月至2019年3月在上海交通大學醫學院附屬新華醫院接受CRC切除手術治療的24例CRC患者，組織標本cDNA由高學仁教授惠贈。所有患者術前均未接受過放化療，術后均經病理學診斷證實。本研究經嘉興市婦幼保健院醫學倫理委員會審查通過，所有患者簽署知情同意書。

1.2 細胞系 人CRC細胞系（HCT116、SW480、Lovo）、結直腸上皮細胞系（NCM460）均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.3 主要試劑 pCDNA3.1-ZNF667-AS1過表達載體由上海生物工程股份有限公司構建；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；FBS、DMEM培養基、RPMI1640培養基均購自美國Gibco公司；馬血清購自上海生物工程有限公司；Trizol購自生工生物工程（上海）股份有限公司；轉染試劑Lipofectamine 2000購自美國Thermo公司；逆轉錄試劑盒5X Prime ScriptRTMaster Mix購自美國TaKaRa公司；RT-PCR試劑qPCR SYBR Master Mix購自美國YEASEN公司；所有引物在上海生工科技有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1 ZNF667-AS1過表達載體構建 利用PCR法從人類基因組中擴增ZNF667-AS1序列，雙酶切將目的基因通過T4鏈接酶構建到pCDNA3.1-N1空載體上。采用雙酶切法及Sanger測序方法鑒定pCDNA3.1-ZNF667-AS1載體構建成功。

1.4.2 細胞培養 用含10%FBS的DMEM培養基培養SW480、HCT116細胞，含10%FBS的RPMI1640培養基培養Lovo細胞，含10%馬血清的DMEM/F12培養基培養NCM460細胞，各添加0.1 U/L青霉素、0.1 U/L鏈霉素，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，胰酶消化傳代。

1.4.3 細胞系構建 當細胞生長狀態良好且細胞密度達到80%～90%時，用胰酶消化細胞，按5×105個/孔接種至6孔板中；待細胞生長到80%融合時，分別將過表達質粒（pCDNA3.1-ZNF667-AS1）和空載體（pCDNA3.1-N1）4 μg 稀釋在 250 μl無血清 RPMI1640 培養基中，6 μl Lipofectamine 2000稀釋在 250 μl無血清 RPMI1640中，分別單獨孵育5 min后混合，37℃孵育20 min轉入細胞中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養6 h，更換新鮮的含10%FBS的RPMI1640完全培養基。轉染過表達質粒（pCDNA3.1-ZNF667-AS1）細胞為過表達組，轉染空載體（pCDNA3.1-N1）為空載組，未轉染質粒的細胞為對照組。

1.4.4 ZNF667-AS1 mRNA相對表達量檢測 采用RT-qPCR法。取100 mg組織標本或1×105個培養細胞，采用Trizol法提取組織標本或細胞中總RNA，參照Prime－ScriptRTMaster Mix反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄反應，在10 μl體系中加入500 ng總RNA進行cDNA合成。PCR選用2×qPCR SYBR Master Mix，以適量cDNA作為模板，引物濃度0.4 μmol/L；每個待測樣本設置4個平行樣，根據目標基因設計合成相應上下游引物進行PCR 擴增；以β-actin作為內參，采用 2-ΔΔCt法計算 ZNF667-AS1 mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4.5 ZNF667-AS1過表達對SW480細胞增殖的影響 采用CCK-8法。將過表達組、空載組及對照組細胞胰酶消化后，重懸于完全培養基中，調整濃度至20 個/μl；按 100 μl/孔加入 96 孔板中，每組設 5 個復孔。每孔加入10 μl CCK-8，置于培養箱中孵育2 h，連續測量 0、24、48、72、96 h 時在 450 nm 波長處的吸光度值（OD450）。

1.4.6 ZNF667-AS1過表達對SW480細胞克隆形成的影響 采用平板克隆實驗。將過表達組、空載組及對照組細胞胰酶消化后重懸，以1 000個/孔接種于6孔板中，每5 d換1次培養液，第11～14天在顯微鏡下可見單個細胞團細胞數＞100個時吸去培養液，甲醛固定30 min，結晶紫染色30 min后干燥，拍照并計數。

1.5 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料以表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRC組織與癌旁正常組織中ZNF667-AS1 mRNA相對表達量比較 與癌旁正常組織比較，CRC組織中ZNF667-AS1 mRNA相對表達量明顯降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 結直腸癌（CRC）組織與癌旁正常組織中ZNF667-AS1 mRNA相對表達量比較（*P＜0.05）

2.2 人CRC細胞系與結直腸上皮細胞系中ZNF667-AS1 mRNA相對表達量比較 與結直腸上皮細胞系NCM460 比較，人 CRC 細胞系（HCT116、SW480、Lovo）ZNF667-AS1 mRNA相對表達量均明顯降低（均P＜0.05），見圖 2。

圖2 結直腸癌（CRC）細胞系與結直腸上皮細胞系中ZNF667-AS1 mRNA相對表達量比較（*P＜0.05）

2.3 CRC細胞系ZNF667-AS1過表達驗證 在HCT116、SW480細胞中，過表達組ZNF667-AS1 mRNA相對表達量明顯高于空載組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖3。提示構建ZNF667-AS1過表達模型成功，本研究選取SW480細胞的ZNF667-AS1過表達模型用于后續增殖實驗。

圖3 結直腸癌（CRC）細胞系中ZNF667-AS1過表達驗證（a：SW480；b：HCT116；與空載組比較，*P＜0.05）

2.4 ZNF667-AS1過表達對SW480細胞增殖的影響 ZNF667-AS1過表達組與對照組OD450值在第24 h時比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）；在第 48、72、96 h時ZNF667-AS1過表達組OD450值明顯低于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），且隨時間的推移，差異逐漸增大，見圖4。

圖4 ZNF667-AS1過表達對SW480細胞增殖的影響（OD為吸光度值；*P＜0.05）

2.5 ZNF667-AS1過表達對SW480細胞克隆形成的影響 ZNF667-AS1過表達組所形成的克隆數為（122±11）個，明顯少于對照組的（361±13）個，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 5。

圖5 ZNF667-AS1過表達對SW480細胞克隆形成的影響（×10）

3 討論

lncRNA是一類長度＞200個核苷酸的非編碼RNA，參與細胞轉錄及轉錄后調控等過程，在細胞增殖、凋亡、侵襲中發揮重要作用；同時能通過與多種微小RNA等相互作用，參與腫瘤的發生、發展[7-10]。ZNF667-AS1作為一種lncRNA，長度為1837bp，位于19號染色體19q13.43。相關研究最早報道ZNF667-AS1在心肌缺血組織中高表達[11-12]，進而保護細胞免受缺氧損傷[13]。相關數據庫顯示，ZNF667-AS1基因在乳腺癌、結腸腺瘤、子宮頸癌等十幾種腫瘤中呈低表達，主要出現在癌變早期[13-14]。近期亦有研究發現ZNF667-AS1通過抑制JAKU-STAT通路來抑制炎癥反應，進而促進脊髓損傷恢復[15]。在腫瘤中，ZNF667-AS1可通過激活ANK2/JAK2表達來抑制CRC細胞侵襲[16]。本文就ZNF667-AS1在結直腸癌組織中的表達及其對細胞增殖的影響作一探討。

本研究發現，ZNF667-AS1在CRC組織中的mRNA相對表達量較癌旁正常組織明顯降低，提示ZNF667-AS1 mRNA低表達與CRC的發生、發展密切相關。Zhao等[13]研究表明，ZNF667-AS1 mRNA低表達是CRC的獨立預后因子，與本研究結果一致。本研究通過檢測不同CRC細胞系ZNF667-AS1 mRNA表達發現，與結直腸上皮細胞比較，ZNF667-AS1在CRC細胞中的mRNA相對表達量均明顯降低；進一步研究發現，ZNF667-AS1 mRNA相對表達量與CRC細胞增殖及克隆形成有關，在SW480細胞系中過表達ZNF667-AS1，CRC細胞增殖能力明顯下降，克隆形成明顯減少。

綜上所述，ZNF667-AS1在CRC組織中呈低表達，過表達ZNF667-AS1可抑制CRC細胞增殖及克隆形成能力，提示ZNF667-AS1作為一個抑癌因子，參與CRC細胞的生長、增殖進程，可能作為潛在的生物靶點發揮生物學功能。