應用光學相干斷層掃描血管成像評估視網膜血流的可重復性及再現性

王婷婷，朱益華，范夢杰，高茹心，黃星星，張達人，吳仁毅，樊寧，劉旭陽,5

(1.福建醫科大學醫學技術與工程學院眼視光學系，福州 350004；2.福建醫科大學附屬第一醫院眼科，福州 350004；3.廈門大學附屬廈門眼科中心青光眼科，福建 廈門 361000；4.暨南大學附屬深圳眼科醫院青光眼與神經眼科，深圳 518040；5.深圳市人民醫院眼科，暨南大學第二臨床學院，深圳 514080)

光學相干斷層掃描血管成像(optical coherence tomography angiography，OCTA)是一項無創檢測眼底血流變化的成像新技術，具有掃描速度快、軸向分辨率高的特點，能夠清晰地顯示眼底視網膜和脈絡膜不同層面的血流信息[1]，是目前最實用的無創檢查人體血流微循環的方法。眼底熒光素鈉血管造影(fundus fluorescein angiography，FFA)是一項有創的傳統視網膜血管成像檢查技術，需要靜脈注射熒光素鈉造影劑，輕度過敏可出現惡心、嘔吐、皮疹，嚴重過敏時可出現休克等不良反應，不宜用于對患者的反復檢查。此外，FFA在微血管循環異常部位發生熒光素快速滲漏，使檢查人員無法捕獲病灶的大小、形態、深度等量化信息，而OCTA可提供視網膜各層血流量化指標，為臨床分析和科研帶來極大的便利[2]。

重復性研究是指同一操作者使用同一臺儀器對同一批受試者進行重復測量的一致性分析，再現性研究是指不同操作者使用同一臺儀器對同一批受試者進行測量的一致性對比。OCTA作為一種新興的眼底血流成像技術，在青光眼、糖尿病視網膜病變、年齡相關性黃斑變性等多種疾病的輔助診斷中有著重要的參考價值和臨床應用前景。面對這項新技術，為評估其可靠性，有必要對其進行重復性和再現性研究，以便更好地將OCTA技術運用于臨床與科研工作中。

本研究應用Cirrus HD-OCT 5000(蔡司AngioPlexTMCirrus HD-OCT 5000，版本10.0，德國)對正常受試者的黃斑及視盤3mm×3mm區域的淺層視網膜血管進行成像測量，對獲取的血流參數進行分析，重點評估其可重復性及再現性。

1 對象與方法

1.1 對象

本研究為前瞻性臨床研究。收集2020年6月至9月來自廈門大學附屬廈門眼科中心的正常受試者49例。正常受試者來源于本院職工及其親屬。

所有受試者進行病史采集，包括外傷史、眼部疾病史和手術史、家族史、全身性疾病史等，排除以上因素對眼底血流的影響；行常規眼部檢查，包括裸眼視力、醫學驗光、最佳矯正視力(BCVA)、裂隙燈顯微鏡、非接觸眼壓計(佳能TX-20，日本)、眼軸(蔡司IOL-Master 700，德國)、中央角膜厚度(拓普康SP-1P，日本)、眼底照相(蔡司Visucam 524，德國)、視野檢查(蔡司Humphrey 860，德國)、視網膜神經纖維層(retinal nerve fiber layer，RNFL)厚度及神經節細胞復合體厚度(ganglion cell complex thickness，GCCT)(蔡司AngioPlexTMCirrus HD-OCT 5000，德國)。其中，采用Cirrus OCT的Optic Disc 200×200和Macular Cube 512×128掃描模式對視盤及黃斑進行掃描后，應用Pano Map分析模式，計算神經節層(ganglion cell layer，GCL)、內叢狀層(inner plexiform layer，IPL)與RNFL厚度之和，即GCCT值；使受試者平靜后，記錄其血壓及心率。

Humphrey視野計的可靠性要求及納入標準：固視丟失＜33%，假陽性和假陰性誤差均＜25%，視野檢測總偏差概率圖上至少3 個連續點的水平＜2%。正常視野的定義：模式標準差(pattern standard deviation，PSD)＞5%，且青光眼半側視野(glaucoma hemifield test，GHT)在正常范圍。

正常受試者納入標準：1)年齡18～55歲；2)最佳矯正視力≥1.0；3)屈光度-5.50～+1.50 D；4)非接觸式眼壓值＜21 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)(經中央角膜厚度校正后)，無眼壓升高史；5)眼軸長度22.0～28.0 mm；6)中央角膜厚度470～580 μm；7)裂隙燈顯微鏡及眼底檢查眼部結構正常；8)雙眼位正常，中心固視好；9)Humphery視野檢查正常；10)無青光眼家族史；11)無糖尿病、高血壓及其他全身病病史。排除標準：1)存在任何內眼疾??；2)眼球外傷或眼內手術史(除無并發癥的白內障手術外)；3)球鏡≤-6.0或≥+1.5 D、柱鏡絕對值＞1.5 D；4)存在可能影響黃斑、視盤功能和結構的疾病或藥物治療；5)最近1周內使用眼藥(無防腐劑人工淚液除外)；6)無法配合檢查者。

若雙眼符合納入標準，則選擇左眼，若單眼符合納入標準，則選擇該眼。所有受試者均經過2位專業眼科醫生篩查，兩人意見一致則納入，否則排除。所有檢查均由2位經過培訓并有一定經驗的操作者完成。此外，為避免散瞳藥物對眼底血流的影響[3]，以及個體之間對藥物的反應差異，本研究涉及的檢查均未對受試者散瞳。

本研究遵循赫爾辛基宣言，獲得廈門大學附屬廈門眼科中心醫學倫理委員會批準(批準號：XMYKZX-LW-2020-004)并取得受試者知情同意。

5例硬膜下積液自行吸收，7例演變為慢性硬膜下血腫；前者的積液量少于后者[(26.4±14.6)mL vs(80.0±52.3)mL, P=0.002]。演變為慢性硬膜下血腫的7例患者中，5例因血腫厚度>1.5 cm、出現顱高壓或神經功能障礙而進一步行鉆孔引流術；鉆孔手術平均于夾閉術后(9.1±3.8)個月(4～20個月)進行。進一步分析發現，硬膜下積液量越大，其演變為慢性硬膜下血腫的比例越高，慢性硬膜下血腫后須行鉆孔引流手術治療的比例也越高(表2)。

1.2 檢查方法

1.2.1 OCTA檢查

檢查在室內溫度為26 ℃的正常照明環境下進行。受試者在1周內的任意3天的同一時段(上午或下午)(即T1、T2、T3)進行OCTA(蔡司AngioPlexTMCirrus HD-OCT 5000，德國)檢查，每次檢查前使受試者靜坐10 min。T1、T2、T3由操作者A重復掃描，操作者B于T2在操作者A后獨立掃描。受試者處于平靜狀態坐于O CT前，操作者選擇Angiography 3 mm×3 mm掃描模式，囑受試者將下頜放于頜托，額頭緊貼額托，調節下頜托及額托使受試者瞳孔位于OCT內置攝像頭中央且虹膜清晰，囑受試者固視OCT內綠色固視光標，開啟FastTrac?圖像跟蹤功能，該功能應用傅里葉域光學相干斷層光線追蹤技術，通過基于參考點的短相干層干涉法描繪眼球界面的三維結構，以保證前后2次獲取的圖像為眼底同一部位，調整屈光度使受試者眼底圖像清晰且OCT圖像清晰，掃描以黃斑中心凹為中心的3 mm×3 mm和視盤為中心的3 mm×3 mm方形區域。

所有掃描圖像進行質量評估，排除信號強度(signal strength，SS)低于7分、分割錯誤、帶有投射偽影、由于屈光間質混濁或眼球抖動等導致圖像模糊的血流圖像[4]。

1.2.2 數據分析

使用機器配套量化分析軟件(Angio PlexTMMetrix，版本10.0)分析血流參數，選擇視網膜淺層血管層面，圖像中以黃斑中心凹和視盤為中心，分別劃定直徑1 mm(內環)和3 mm(外環)的圓環，并將黃斑及視盤分為上方、下方、鼻側、顳側4個象限環形區域(圖1)，獲得黃斑及視盤上方、下方、鼻側、顳側4個區域的血管長度密度(vessel leng th densit y，VD)、血管灌注密度(vascular perfusion density，PD)。

圖1 黃斑、視盤3 mm×3 mm OCTA成像在眼底照片的對應位置Figure 1 Corresponding positions of the 3 mm×3 mm OCTA imaging of macular and peri-papillary superficial capillaries at the fundus photo

1.3 統計學處理

采用SPSS 25.0軟件和MedCalc 18.2.1軟件進行數據分析。計量資料分別采用Shapiro-Wilk檢驗和Levene檢驗進行數據正態性和方差齊性檢驗，若數據符合正態性和方差齊性，兩組以上均數比較采用單因素方差分析，結果以均數±標準差()表示；若不符合正態性或(和)不符合方差齊性，兩組以上均數比較采用非參數Kruskal-Wallis H秩和檢驗。采用可靠性分析計算組內相關系數(intraclass correlation coefficient，ICC)、變異系數(coefficient of variation，CV)評價操作者內重復性。按Landis和Koch的建議[5]，ICC＞0.8為良好重復性，0.61～0.80為中等重復性，0.41～0.60為一般重復性，0.11～0.40為較低重復性，ICC＜0.1為無重復性。CV＜10%代表重復性較好[6]。采用一致性相關系數(consistent correlation coefficient，CCC)、重復性系數(repeatability coefficient，CR)、CV評價操作者間再現性。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 正常受試者的一般資料

本研究1 例受試者的掃描圖像因S S ＜7 被排除，2例受試者的掃描圖像因分割錯誤被排除，6例受試者的掃描圖像因眼球的運動偽影被排除，最終共40只眼納入研究，其中左眼37只，右眼3只(表1)。所有受試者進行OCTA掃描前的收縮壓、舒張壓和心率測量(表1)，結果顯示受試者處于平靜狀態。

表1 受試者一般資料Table 1 Characteristics of subjects

2.2 同一操作者對黃斑及視盤血流參數測量的重復性分析

經Shapiro-Wilk檢驗，僅黃斑下方PD測量值符合正態分布，且經Levene檢驗方差齊(均P＞0.05)，其余血流參數檢測值不符合正態分布(表2)。比較操作者A對正常受試者黃斑各區域3次掃描的VD和PD均值經單因素方差分析顯示：3次掃描之間的黃斑下方PD差異無統計學意義(均P＞0.05，表2)；非參數Kruskal-Wallis H秩和檢驗顯示：3次掃描之間的黃斑上方VD及PD、下方VD、鼻側VD及PD、顳側VD及PD差異無統計學意義(均P＞0.05，表2)。

表2 操作者A在不同時間點對正常眼黃斑血流參數測量的重復性分析Table 2 Repeatability analysis of the measurements of superficial macular capillaries blood flow parameters at different time points by operator A

經Shapiro-Wilk檢驗，視盤顳側VD、PD測量值符合正態分布，且經Levene檢驗方差齊(均P＞0.05)，其余血流參數檢測結果不符合正態分布(表3)。操作者A對正常眼視盤各區域3次掃描的VD和PD均值經單因素方差分析顯示：3次掃描之間的視盤顳側VD、PD差異均無統計學意義(均P＞0.05，表3)；非參數Kruskal-Wallis H秩和檢驗結果顯示：3次掃描之間的視盤上方、下方、鼻側VD及PD差異無統計學意義(均P＞0.05，表3)。

操作者A對視盤各區域3次掃描的血流參數的重復性分析顯示：顳側VD、PD的ICC值為0.863和0.848，上方VD及PD、下方VD、鼻側VD的ICC值為0.663～0.744，下方PD及鼻側PD的ICC值為0.599和0.577。操作者A對視盤各區域VD和PD的CV均＜5.3%(3.260%～5.260%，表3)。

表3 操作者A在不同時間點對正常眼視盤血流參數測量的重復性分析Table 3 Repeatability analysis of the measurements of peri-papillary superficial capillaries blood flow parameters at different time points by operator A

2.3 不同操作者對黃斑及視盤血流參數測量的再現性分析

兩名操作者之間對正常受試者黃斑及視盤區VD、PD測量的再現性見表4，5。黃斑上方和鼻側的VD、PD的CCC值為0.5125～0.5665，黃斑下方和顳側的VD、PD的CCC值為3130～3808。黃斑區VD的CR值為3.2212～4.6399，PD的CR值為0.0564～0.0832；黃斑區各區域3次掃描VD和PD的CV值均＜9.0%(5.801%～8.999%，表4)。

表4 不同操作者在同一時間點對正常眼黃斑血流參數測量的再現性分析Table 4 Reproducibility analysis of the measurements of superficial macular capillaries blood flow parameters at the same time point by different operators

視盤上方VD、下方VD及PD、顳側VD及PD的CCC值為0.6270～0.7801，視盤上方PD、鼻側VD及PD的CCC值為0.5149～0.5847。視盤區VD的CR值為2.0675～4.0630，PD的CR值為0.0447～0.0730；視盤區各區域VD和PD的CV值均＜7.2%(3.710%～7.121%，表5)。

表5 不同操作者在同一時間點對正常眼視盤血流參數測量的再現性分析Table 5 Reproducibility analysis of the measurements of peri-papillary superficial capillaries blood flow parameters at the same time point by different operators

3 討論

OCTA是一項快速、無創、可定量評估視網膜和脈絡膜微血管血流情況的血管成像技術，其原理是對眼底血管中流動的紅細胞進行快速重復的相干光層析成像，并通過特殊的計算方法，獲得眼底視網膜各層面的血流信號[7]。OCTA在眼科臨床及科研上有重要意義，研究[8]表明：原發性開角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)的發病機制與眼部及全身血流因素相關，但具體機制尚不明確，而OCTA可以確切了解視網膜血流情況，從人眼活體、動態觀察眼底血流的角度來認識POAG發病機制，為臨床診療提供新思路，也因此研究OCTA儀器的重復性和再現性尤為重要。

OCT配有不同的掃描范圍、層面分析模式，掃描范圍越大，儀器對眼底血流圖像的精確分析能力越低[9]，因此本研究選擇掃描范圍3 mm×3 mm以獲取分辨率相對較高和較準確的圖像進行分析。當儀器發射出的光波穿透淺層血管到達深層血管并反射回探頭時，儀器會把淺層血管的投影(即血管投射偽影)誤認為是深層血管，造成血管量化分析誤差，因此本研究選擇視網膜淺層血管進行檢測參數的重復性分析。

Xiao等[10]和趙琦等[11]發現：黃斑3 mm×3 mm中心、內環的VD、PD測量值的日內重復性良好[ICC=0.87～0.97，CV=(1.2±1.0)%～(4.2±5.5)%]，但作者沒有研究不同日的重復性及再現性；而在實際臨床工作中，眼科醫生對患者病情的追蹤和隨訪都不是在同一天，因此本研究選取不同天進行OCTA重復掃描更具有實際意義，也有必要進行間隔時間更長的相關研究。

本研究選取1周內3天的同一時段對黃斑及視盤3 mm×3 mm血流參數進行重復性和再現性研究，結果顯示：非同日的視盤血流參數有較好的重復性及再現性，而黃斑血流參數的重復性及再現性相對較低。與其他作者的前期研究[10-11]相比，本研究黃斑血流參數重復性及再現性略低，可能原因有：1)眼底圖像SS前后不一致。眼底圖像質量常以SS來評判，在目前的臨床實踐和研究中，普遍認為SS≥6代表圖像質量好，該圖像便被納入研究中。但多項研究[12-14]發現：SS是影響重復性及再現性的重要因素之一，SS前后差異越大，OCTA參數的可靠性越低。Lei等[14]報道：當SS增加1個單位時，VD增加1.4 mm-1，PD增加0.03。趙琦等[11]報道：黃斑3 mm×3 mm血流參數重復性好，可能原因是其納入了SS≥8的圖像，而本研究納入了SS≥7的圖像，增大了SS對重復性影響的可能性。但對于視力較差且配合欠佳的患者，采用SS≥8的標準過于苛刻，缺乏實際意義，因此SS≥7相對更符合實際臨床工作。Lei等[14]提出在獲取OCTA圖像時，不僅要提高圖像的SS，更要盡量保持前后圖像的SS一致，使前后血流參數更具可比性，更有利于在臨床中對患者病情的跟蹤和隨訪。2)OCTA掃描過程中的客觀因素多且復雜，而不同日的檢查更能代表實際臨床工作情況。盡管本研究已盡量控制外界影響因素(如檢查時間、室溫及環境條件等)，但與同一天檢查相比，受試者本身的生理變化、情緒波動、配合程度等造成眼底血流的改變較大。同理，非同日條件下操作者的不同生理、心理狀態等也會影響測量結果。因此，在OCTA掃描過程中，令受試者閉眼休息、離座走動，必要時提供人工淚液，提高受試者配合程度，可以獲取更佳的圖像質量，提高重復性及再現性。

正常人眼注視目標時，會產生不易察覺的頻繁而有規律的細微運動，稱為注視性眼球運動[15]。當以更少的掃描時間和開啟FastTracTM圖像跟蹤功能掃描時，可以減少眼球運動偽影對圖像質量造成的影響。本研究所用的Cirrus HD-OCT 5000掃描速度為68 000 A掃/s，理想條件下3 mm×3 mm范圍OCTA掃描時間為5 s，掃描過程中需要患者保持最佳固視狀態，但因受試者眨眼、不自覺的眼球抖動造成的血流圖像質量欠佳，也有可能導致血流參數的重復性降低。Fenner等[16]也提到運動偽影是影響視網膜淺層血管參數重復性的因素之一，因此，每次掃描前囑受試者眨眼并對其進行固視宣教是有必要的。目前，OCTA掃描中屈光度的調節是通過操作者目測顯示器中眼底圖像的清晰度來判斷的，其受主觀因素影響較大，而眼底圖像的清晰度直接影響成像質量[17]，這也影響檢查結果的重復性及再現性。在掃描過程中，正常受試者的瞳孔在光刺激下收縮，若在掃描過程中因為瞳孔收縮導致眼底入射光線不足在眼底圖上形成暗區，對應暗區血流密度下降，因此建議進行OCTA檢查前常規散瞳。

目前，對視盤3 mm×3 mm血流參數重復性及再現性的研究不多。Mastropasqua等[18]報道了視盤4.5 mm×4.5 mm的VD具有良好的重復性及再現性(ICC=0.767及0.762，CCC=0.6590～0.8891)。本研究發現：視盤3mm×3mm血流參數重復性及再現性優于黃斑(ICC=0.577～0.863，CCC=0.5149～0.7801)，可能是由于視盤存在視網膜中央動脈及睫狀后動脈大血管，其血流較黃斑區穩定，而黃斑區由于中心凹無血管區(foveal avascular zone，FAZ)的存在，整體血流密度明顯低于視盤區，血流變化對于黃斑區的影響明顯大于視盤區，最終導致視盤區比黃斑區重復性及再現性好。

本研究存在一定的局限性。首先，樣本量偏小，由于眼部血流變化與生理及環境等多種因素有關，同時檢查結果受操作者及受試者當時心理及生理狀態影響，故需要進一步擴大樣本量，增加檢測指標，進一步排除干擾因素。其次，未評估黃斑FAZ的重復性及再現性，原因是機器自動測量FAZ參數的重復性及再現性不如手動測量，存在一定的系統誤差[19]，本研究也未分析眼軸和體重指數(body mass index，BMI)對OCTA測量視網膜血流參數的重復性及再現性的影響，將在日后的工作中進一步探討。

綜上所述，非同日的同一時段下黃斑3 mm×3 mm淺層血流參數有一般或較低的重復性及再現性，可能與受試者生理、心理狀態、理解及配合程度、瞳孔大小、運動偽像、圖像SS、操作者掃描主觀判斷有關；視盤3 mm×3 mm淺層血流參數具有較好的重復性及再現性。提示OCTA的檢查結果可供臨床醫生參考，但仍需結合其他輔助檢查綜合分析以做出正確的判斷。