馬鈴薯優良雜種株系細胞遺傳學特性及SRAP分析

李景偉，于 卓，于肖夏，李佳奇，盧倩倩，吳國芳，李 靚

(內蒙古農業大學農學院，內蒙古 呼和浩特 010019)

馬鈴薯是世界上重要的糧食作物[1-2]，其塊莖中含有豐富的淀粉、維生素、膳食纖維、礦物質、蛋白質和花青素等營養成分，可滿足人體需要的各種營養需求[3-5].近年來，我國逐漸意識到馬鈴薯在糧食安全、國民經濟、生態安全等方面的重要作用，于2016年由國務院批準實施馬鈴薯主糧化戰略[6].在國家政策的引導下，我國馬鈴薯種植面積及其總產量明顯增加.但與美國、荷蘭、加拿大等馬鈴薯產業鏈發展良好的國家相比，我國多以鮮食型馬鈴薯品種為主，而淀粉、全粉、薯條薯片等加工專用型馬鈴薯新品種嚴重缺乏，遠不能滿足當前消費市場的需求[7].隨著馬鈴薯產業的快速發展，亟待引進和拓寬加工專用型的馬鈴薯的種質資源，并在確保育成品種優質、高產、抗逆性強等優點的前提下，需充分改良現有品種的加工品質特性，提高其加工原料的品質.因此，開展優良加工專用型馬鈴薯新品種的選育研究工作十分必要.

SRAP(Sequence related amplified polymorphism)序列相關擴增多態性標記，是一種可直接進行PCR擴增且無須特定序列信息的新型分子標記，因其具有重復性和通用性好、多態性豐富、操作簡單且成本低等特點，已被廣泛應用在多種作物的遺傳圖譜構建、遺傳多樣性分析、種質資源研究等領域[8].

為培育出優質高產、抗逆性強、商品性好、生育期較短，適宜內蒙古地區推廣種植的優良加工專用型馬鈴薯新品種，近年來本課題組以雙親遺傳差異大、優缺點互補為親本選配原則，用抗病性弱但塊莖產量和商品薯率高、薯型好、芽眼淺、紅皮白肉的‘美紅-09’(MH-09)材料作母本，以抗病性強、高干物質和高淀粉含量、深紅皮紅肉的‘MIN-21’材料為父本，通過人工套袋去雄授粉雜交獲得2 604個雜種F1代分離單株群體.經在溫室和大田對雜種后代進行多次選擇，從中選出了綜合農藝性狀表現突出的8個優良雜種株系：ZX-20、ZX-460、ZX-780、ZX-900、ZX-1120、ZX-1540、ZX-1960和ZX-2200.

本試驗以這8個優良雜種株系及其親本為材料，采用醋酸洋紅花粉粒染色及卡寶品紅染色體壓片法，分別對其花粉育性及花粉母細胞減數分裂中期I(PMIM I)的染色體配對行為進行了觀察分析，并對其基因組DNA進行了SRAP分析，以明確各雜種株系間花粉育性情況、染色體配對構型特征和DNA水平的遺傳差異，以為下一步馬鈴薯新品系(品種)的育成、登記應用提供分子細胞學依據.

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為從馬鈴薯雜交組合‘MH-09×MIN-21’的雜種F1代群體中選育出的8個優良雜種無性株系ZX-20、ZX-460、ZX-780、ZX-900、ZX-1120、ZX-1540、ZX-1960和ZX-2200及其親本.種薯級別為原種，由內蒙古農業大學馬鈴薯育種研究所保存、提供.各供試材料的塊莖表型特征如圖1所示.

a：ZX-20，b：ZX-460，c：ZX-780，d：ZX-900，e：ZX-1120，f：ZX-1540，g：ZX-1960，h：ZX-2200，i：♀MH-09，j：♂MIN-21

1.2 試驗地概況及田間管理方法

2018年5月6日，將各供試材料種植在呼和浩特市托克托縣古城鎮馬鈴薯試驗研究基地.試驗區的地理位置為東經111°45′、北緯40°57′，海拔約1 061 m.試驗區年平均降雨量為336.2～535.7 mm，無霜期約145 d，生育期日照時間約1 600 h；土壤為沙壤質土，肥力中等，pH呈弱堿性，具備良好的噴灌條件.各材料按隨機區組排列設計，采用單壟穴播方式種植，株距30 cm，行距90 cm，播種深度10 cm左右，小區面積20 m2，設3次重復.播種前用完全腐熟的牛糞(2.25 kg/m2)作為基肥，馬鈴薯復合肥(0.07 kg/m2)作種肥.在生育期內適當追施氮肥(0.05 kg/m2)，分3次施入.在株高約15 cm時，進行中耕培土.在整個生育期，注意防除病蟲和雜草的危害，適時灌水滿足植株生長發育對水分的需求.

1.3 花粉育性的觀測

在開花期，取8個優良雜種株系及其親本材料正在開放的花蕾，分別放在羊皮紙袋內帶回實驗室.用鑷子將花粉均勻地抖落在載玻片上，醋酸洋紅染液均勻染色后加蓋玻片，用Olympus BX51的顯微鏡10倍下觀察各材料的花粉育性情況.每個材料觀察100個視野以上，統計出可育花粉與不可育花粉的數目并拍照[9].觀察的標準為：花粉粒飽滿、均勻著色的記為可育花粉粒，花粉粒空癟、皺縮扁小畸形、不著色的記為不可育花粉[10].

花粉可育率=(可育花粉粒數/花粉粒統計總數)×100%.

1.4 PMCMⅠ染色體配對構型觀測

馬鈴薯現蕾期間，在上午的8：00—10：00，隨機取各雜種株系及其親本的幼小花蕾(0.2 cm)，將鮮樣迅速放入裝有卡諾液(V無水乙醇∶V冰醋酸=3∶1)的具塞試管中帶回室內，置4℃冰箱內固定約24 h后，用清水沖掉卡諾液及雜質，加入70%的酒精于4℃冰箱內保存、備用[11].制片時，將花粉母細胞擠壓到干凈的載玻片上，去除花藥壁，滴加卡寶品紅染液染色約10 s后壓片.用Olympus顯微鏡于100倍油鏡下觀察供試材料的染色體配對行為，挑選染色均勻、清晰穩定的細胞染色體進行照相，并統計染色體數目[12-13]，每個材料觀察細胞數在140個以上，參照李懋學等[14]提出的方法對各雜種株系的染色體構型進行觀察統計.

1.5 供試材料的DNA提取與純度檢測

在苗期隨機取各材料的幼嫩葉片，按照北京天根公司生產的DNA試劑盒說明書提取其基因組DNA.取2 μL 樣本DNA溶液，用1.3%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度后，稀釋至50 ng/μL，置-40℃冰柜中保存、備用.

1.6 SRAP-PCR擴增體系及程序

PCR反應體系：總體積為20 μL，其中包含上、下游引物(0.5 μmol/L)各1.2 μL，2.5 μL的10×PCR buffer(含Mg2+)，2.5 μL模板DNA(50 ng/μL)，1.6 μL dNTPs(0.225 mmol/L)，0.2 μL Taq DNA聚合酶(5 U)和10.8 μL ddH2O.實驗所用的生化試劑均購自北京全式金生物工程有限公司.

PCR擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，5個循環；94℃變性，50℃退火，72℃延伸1 min，40個循環；72℃延伸10 min后，將擴增產物置于4℃冰箱內低溫保存.PCR反應在Bio-Rad Mycycler Thermal Cycler基因擴增儀上進行[15].

1.7 SRAP適宜引物的篩選

從Li等[16]、Pezzotti等[17]和Lin等[18]報道的SRAP引物中，隨機選取正向12條、反向12條引物，自由組合成144對引物，委托南京金斯瑞生物科技有限公司進行合成.通過預實驗從中篩選出10對多態性豐富、條帶位點穩定、清晰的SRAP特異性引物(見表1)，用于8個馬鈴薯優良雜種株系及其親本遺傳差異的SRAP分析.

表1 篩選出的SRAP適宜引物及其堿基序列

1.8 擴增產物的電泳檢測及SRAP多態性位點條帶

用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳對供試材料基因組DNA 的PCR擴增產物進行檢測.依據Nei[19]提出的方法，統計各引物擴增出的SRAP等位基因多態性位點條帶和總位點條帶，計算出多態性位點條帶百分率(Percentage of polymorphic bands，P).P=(M/N)×100%，式中：M為擴增出的多態性位點條帶數，N為擴增出的總位點條帶數.

1.9 數據的整理分析

用EXCEL2010和SPSS(Statistical product and service solutions)22.0軟件對各雜種株系的花粉可育率觀測數據進行差異顯著性分析.采用DPS(Data processing system)V7.05軟件進行SRAP遺傳距離的聚類分析

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯優良雜種株系間花粉育性的差異

8個優良雜種株系及其親本的花粉育性觀測結果見圖2、表2.親本間的花粉可育率在60%左右，二者差異不明顯，各株系間的花粉可育率存在一定差異.株系ZX-900的花粉可育率最高，為77.3%；株系ZX-1120、ZX-460和ZX-20的花粉可育率相近，在68.0%～71.8%之間，三者差異不顯著，但與親本存在顯著差異；株系ZX-780和ZX-2200分別為61.3%和64.4%，二者差異不顯著，且與其雙親差異顯著；株系ZX-1960和ZX-1540的花粉可育率均較低，分別為55.4%和48.1%，差異顯著.以上結果表明，除株系ZX-1540外，其余7個雜種株系的花粉育性均超過50%，可作父本材料進一步用于雜交改良.

2.2 雜種株系間的PMCMⅠ染色體配對行為

各雜種株系及其親本的染色體構型如表2和圖3所示.母本‘MH-09’的染色體構型為2n=4x=48=5.38Ⅰ+8.98Ⅱ+4.63Ⅲ+2.69Ⅳ，父本‘MIN-21’的染色體構型為2n=4x=48=2.80Ⅰ+9.35Ⅱ+4.51Ⅲ+3.23Ⅳ.各株系間的單價體頻率變幅在1.13～8.44之間，二價體頻率變幅在7.08～15.54之間，三價體頻率變幅在1.04～6.76之間，四價體頻率變幅在1.33～5.09之間.8個雜種株系ZX-20、ZX-460、ZX-780、ZX-900、ZX-1120、ZX-1540、ZX-1960和ZX-2200的染色體構型有一定差別，依次分別為：2n=4x=48=3.82Ⅰ+13.05Ⅱ+2.31Ⅲ+2.79Ⅳ，2n=4x=48=6.52Ⅰ+13.04Ⅱ+2.24Ⅲ+2.17Ⅳ，2n=4x=48=4.37Ⅰ+9.97Ⅱ+3.19Ⅲ+3.53Ⅳ，2n=4x=48=4.05Ⅰ+15.54Ⅱ+2.12Ⅲ+1.63Ⅳ，2n=4x=48=2.71Ⅰ+13.85Ⅱ+2.35Ⅲ+2.64Ⅳ，2n=4x=48=8.44Ⅰ+7.08Ⅱ+5.92Ⅲ+1.91Ⅳ，2n=4x=48=5.20Ⅰ+8.61Ⅱ+6.76Ⅲ+1.33Ⅳ和2n=4x=48=1.13Ⅰ+11.69Ⅱ+1.04Ⅲ+5.09Ⅳ.

表2 8個優良雜種株系及其親本的花粉育性

a：ZX-20，b：ZX-460，c：ZX-780，d：ZX-900，e：ZX-1120，f：ZX-1540，g：ZX-1960，h：ZX-2200，i：♀MH-09，j：♂MIN-21

2.3 優良雜種株系及親本基因組DNA的SRAP分析

8個馬鈴薯雜種株系及其親本的基因組DNA電泳條帶明亮、穩定、均勻，無彌散現象產生，表明所提取的各材料DNA純度很高，完全可滿足SRAP分子標記電泳分析的質量要求.用篩選出的10對SRAP適宜引物，對8個雜種株系及其親本基因組DNA的擴增結果顯示，共有180個清晰穩定的SRAP位點條帶，其中多態性位點條帶122個，多態性平均比率為65.92%，表明各材料間在DNA水平上有明顯的遺傳差異(見表3、圖4A).

實驗還選出1對特異性SRAP引物M5BE7，經擴增建立的指紋圖(見圖4B)可清晰地將各雜種株系間及親本區分開來.這表明SRAP引物M5BE7可從DNA分子水平上識別8個雜種株系的遺傳差異，可為下一步雜種新品系及品種的育成、登記提供了分子依據.

表3 8個優良雜種株系及其親本的SRAP擴增結果

A：DNA純度檢測；B：引物M5BE7擴增指紋.M1：DNA Marker DL100；M2：DNA Marker DL2000

2.4 雜種株系及親本的遺傳距離和聚類分析

由表4可見，10個材料的遺傳距離(GD)變動在0.290～0.640之間，平均距離為0.442.其中株系ZX-1540與父本‘MIN-21’的遺傳距離最大(GD值=0.640)，說明二者的遺傳差異較大.株系ZX-780與父本‘MIN-21’的遺傳距離最小(GD值=0.290)，其遺傳差異相對較小.

以GD值0.40為基準，可將10個材料劃分為5類：株系ZX-20、ZX-1960與母本‘MH-09’為一類，說明ZX-20、ZX-1960偏母本遺傳；株系ZX-780、ZX-1120、ZX-2200與父本‘MIN-21’分為一類，這3個雜種株系偏父本遺傳；株系ZX-460、ZX-900、ZX-1540單獨為一類，表明這3個雜種株系間遺傳差異相對較小(見圖5)

表4 各株系及其親本的遺傳距離矩陣

3 討論

3.1 染色體配對行為與花粉育性的關系

圖5 10個供試材料的SRAP聚類

染色體是DNA遺傳物質的載體，觀測雜種材料的染色體配對行為是從細胞學水平上了解不同植物材料遺傳差異的基礎，而明確雜種材料花粉育性的高低對其后續雜交改良、利用具有理論指導意義，染色體的正常分離是花粉可育的基礎[20].染色體的配對行為是由多個基因精準調控的，任何基因的變異均會導致減數分裂異常，致使花粉敗育，染色體聯會時發生的不均等分離也會導致花粉不育.已有的研究表明，植物的染色體構型中二價體頻率較高時，其花粉可育率較高，若單價體和多價體的頻率較高，花粉可育率則較低[21].其原因是二價體頻率高可使同源染色體正常聯會，花粉育性高；而單價體和多價體頻率高會引起聯會的同源染色體分離不均衡，染色體配對異常，致使花粉育性降低[22].

本試驗對8個馬鈴薯雜種株系的染色體構型進行的觀測表明，株系ZX-900和ZX-1120的花粉可育率較高(分別為77.3%和71.8%)，其二價體頻率亦較高(分別為15.54和13.85)，而單價體和多價體頻率相對較低(分別為4.05和2.71)；ZX-1540和ZX-1960的花粉可育率最低(分別為48.1%和55.4%)，其二價體頻率亦最低(分別為7.08和8.61)，而單價體和多價體頻率較高(分別為8.44和5.20).這表明不同雜種株系花粉可育率的高低與其二價體頻率的高低呈正相關，與單價體及多價體頻率呈負相關，這與已有的研究結果相吻合，可為后續8個優良雜種株系作為中間材料進一步雜交改良利用，提供可靠的細胞遺傳學依據.

3.2 分子標記的有效性

分子標記是作物遺傳育種研究的重要輔助工具，可明顯縮短育種進程，因其是建立在基因組DNA水平上的一類新型技術，是植物基因的直接表現，且可排除環境因素的影響，因此備受育種者的重視.McGregor等[23]利用SSR標記對39個南美當地馬鈴薯栽培品種進行了分析，4對SSR引物有效區分了其中的24個材料；Norero等[24]利用SSR標記對來自德國等12個國家的37個馬鈴薯品種進行了分子鑒定，用3對引物可將其中的36個品種區分開來.與SSR標記相比，SRAP標記技術具有多態性位點多、引物通用性強、引物組合可以隨機排列形成許多新的引物對、成本較低廉且操作簡單等優勢，故近幾年來其應用研究較多.例如，張建成等[25]對10個國內花生栽培種的SRAP標記研究表明，SRAP標記技術可以很好地體現出花生栽培種的遺傳差異性；程永芳等[26]利用SRAP標記技術對54份馬鈴薯種質資源的遺傳多樣性進行了分析，并對50個雜種F1單株進行了分子鑒定，證明馬鈴薯品種間具有豐富的遺傳多樣性且遺傳差異較大.本試驗利用自由組合成的144對SARP引物篩選出的10對適宜引物，對8個馬鈴薯優良雜種株系及親本材料的基因組DNA進行PCR擴增，獲得122個SRAP多態性位點條帶，其多態性比率達65.92%，表明各供試材料間具有較大的遺傳差異，可為后續雜種株系作為中間材料再利用及馬鈴薯新品系的培育提供分子依據.實驗還利用篩選出的1對SRAP特異性引物M5BE7，經PCR擴增建立了能很好識別各優良雜種株系及親本的SRAP指紋圖.這也表明SRAP分子標記技術用于馬鈴薯雜種株系的鑒定是可靠的，可為下一步新品種的育成登記奠定基礎.

4 結論

(1) 8個馬鈴薯優良雜種株系的花粉可育率變幅為48.1%～77.3%，株系間花粉育性存在一定差異.株系ZX-1540的花粉育性最低(<50%)，適宜作母本中間材料雜交改良利用；其余7個株系的花粉育性均在55%以上，可作父本材料改良利用.

(2) 8個雜種株系ZX-20、ZX-460、ZX-780、ZX-900、ZX-1120、ZX-1540、ZX-1960和ZX-2200的染色體配對構型，依次分別為：3.82Ⅰ+13.05Ⅱ+2.31Ⅲ+2.79Ⅳ，6.52Ⅰ+13.04Ⅱ+2.24Ⅲ+2.17Ⅳ，4.37Ⅰ+9.97Ⅱ+3.19Ⅲ+3.53Ⅳ，4.05Ⅰ+15.54Ⅱ+2.12Ⅲ+1.63Ⅳ，2.71Ⅰ+13.85Ⅱ+2.35Ⅲ+2.64Ⅳ，8.44Ⅰ+7.08Ⅱ+5.92Ⅲ+1.91Ⅳ，5.20Ⅰ+8.61Ⅱ+6.76Ⅲ+1.33Ⅳ和1.13Ⅰ+11.69Ⅱ+1.04Ⅲ+5.09Ⅳ.

(3) 篩選出SRAP適宜引物10對，經PCR擴增獲得了122個多態性位點條帶，多態性比率占65.92%.利用SRAP特異性引物M5BE7，構建了能明確識別8個優良雜種株系及其親本的SRAP指紋圖.

(4) 8個雜種株系及其雙親的遺傳距離(GD)變幅為0.290～0.640，平均為0.442.以GD值0.40為基準，將10個材料分為5類：第一類為株系ZX-20、ZX-1960和母本‘MH-09’；第二類為株系ZX-780、ZX-1120、ZX-2200和父本‘MIN-21’；株系ZX-460、ZX-900和ZX-1540各單獨成一類.