康復新凝膠劑對小鼠創面組織修復的作用及相關機制探討

薛堯 展冠軍 馬靜

[摘要]目的：觀察康復新凝膠劑對小鼠皮膚創面損傷的作用，并探討其可能的作用機制。方法：60只C57BL/6J小鼠隨機分成模型組、康復新凝膠劑組（凝膠劑組）、林可霉素利多卡因凝膠劑組（林可霉素組），每組20只，采用全層皮膚切除法在C57BL/6J小鼠背部制備傷口，傷口造模后開始按組對應給藥10d;于治療第3、7、10天拍照觀察傷口圖像并計算創面愈合率;酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血液中白細胞介素-6（IL-6）與轉化生長因子-β（TGF-β）的含量;于治療后第10天處死各組小鼠，蘇木精-伊紅染色法（HE）觀察創面組織變化;免疫組化染色檢測創面組織血管內皮生長因子（VEGF）、M1型巨噬細胞標志物（iNOS）與M2型巨噬細胞標志物（CD206）蛋白表達;熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測創面組織中IL-6、TGF-β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）與白細胞介素-10（IL-10）mRNA表達水平。結果：與模型組比較，康復新凝膠劑組小鼠于治療后第3、7、10天傷口愈合較為明顯，創面愈合率顯著增加，差異有統計學意義（P<0.05）;血清中IL-6含量顯著下降且TGF-β含量顯著升高（P<0.05）。治療10d后，與模型組比較，康復新凝膠劑組小鼠創面炎性細胞浸潤明顯，新生致密肉芽組織，有大量新生毛細血管形成，同時VEGF陽性表達率顯著增加（P<0.05），IL-6、TNF-α mRNA表達水平顯著下降（P<0.05），IL-10、TGF-β mRNA表達水平顯著升高（P<0.05），iNOS陽性細胞數顯著減少而CD206陽性細胞數顯著增加（P<0.05），且與林可霉素利多卡因凝膠劑作用等效。結論：康復新凝膠劑能夠促進小鼠傷口愈合，減輕傷口部位炎癥反應，其機制可能與創面巨噬細胞表型轉化有關。

[關鍵詞]創面損傷;康復新凝膠劑;林可霉素利多卡因凝膠劑;巨噬細胞;炎癥反應

[中圖分類號]R622? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）04-0110-05

Study on the Effect and Related Mechanism of Kangfuxin Gel on the Repair of Mice Wound Tissue

XUE Yao，ZHAN Guan-jun，MA Jing

[Department of Pharmacy，Nanjing Dachang Hospital（Jiangbei Campus of Zhongda Hospital Affiliated to Southeast University），Nanjing 210048，Jiangsu，China]

Abstract： Objective? To observe the effect of Kangfuxin Gel on skin wounds in mice and explore its possible mechanism. Methods? 60 C57BL/6J mice were randomly divided into the model group， the Kangfuxin gel group （gel group） and the lincomycin lindocaine gel group （lincomycin group）， 20 mice in each group. Used full-thickness skin excision method to prepare wounds on the back of C57BL/6J mice. After wound modeling， start to administer drugs according to the group for 10 days. Taked pictures and observe wound images on the 3， 7 and 10 days of treatment and calculate the wound healing rate. Detectted the levels of interleukin-6 （IL-6） and transforming growth factor-β （TGF-β） in the blood by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The mice of each group were sacrificed on the 10th day after treatment. Hematoxylin-Eosin staining method （HE） observes the changes of wound tissue. Immunohistochemical staining was used to detect the protein expression of vascular endothelial growth factor （VEGF）， M1 macrophage marker （iNOS） and M2 macrophage marker （CD206） in wound tissue. Fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） was used to detect the mRNA expression levels of IL-6， TGF-β， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-10 （IL-10） in wound tissues. Results? Compared with the model group， mice in the Kangfuxin gel group had more obvious wound healing on the 3， 7 and 10 days after treatment， the wound healing rate increased significantly， the differences were statistically significant （P<0.05）. The serum IL-6 content decreased significantly and the content of TGF-β increased significantly （P<0.05）. After 10 days of treatment， compared with the model group， the inflammatory cell infiltration in the wound surface of the Kangfuxin gel group was obvious， new dense granulation tissue， a large number of new capillaries were formed， and the VEGF positive expression rate was significantly increased （P<0.05）， IL-6 and TNF-α mRNA expression levels decreased significantly （P<0.05）， IL-10 and TGF-β mRNA expression levels increased significantly （P<0.05）， the number of iNOS positive cells decreased significantly while the number of CD206 positive cells increased significantly （P<0.05）， and was equivalent to lincomycin and lindocaine gel. Conclusion? Kangfuxin gel can promote wound healing in mice and reduce the inflammatory response at the wound site. The mechanism may be related to the phenotypic transformation of macrophages on the wound surface.

Key words： wound injury; Kangfuxin gel; Lincomycin lidocaine gels; macrophage; inflammatory reaction

皮膚持續暴露于外部極易受到各種創傷，皮膚受傷后會觸發一系列復雜生理病理過程來進行創面愈合，主要涉及以下四個階段：凝血，炎癥，遷移-增殖和重塑，任何一個階段功能出現障礙都會導致傷口愈合受阻[1-3]。創面若不能有效、快速愈合，則會導致繼發感染甚至引發死亡[4]，嚴重影響著患者的生活質量與健康，探究加速創面愈合并改善愈合質量的新策略對于患者來說至關重要。巨噬細胞是源于血液系統中的單核細胞，也是先天性免疫的重要組成部分。研究表明，巨噬細胞及其分泌的相關因子在創面愈合的所有階段均發揮著至關重要的作用[5-7]。巨噬細胞活化后可被分為兩種不同的表型，即M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞。研究表明，在創面的炎癥發生發展過程中，巨噬細胞的表型轉化直接影響著創面愈合的速度與質量[8]。康復新凝膠劑是由大蟾干燥蟲體的乙醇提取物制成的外用制劑，其液體制劑具有激活創面免疫活性細胞、調節炎性反應以及快速促進傷面愈合的作用[9]。本研究旨在觀察康復新凝膠劑對小鼠皮膚創面的促愈合作用，通過對傷口部位進行組織學及分子生物學分析，探討康復新凝膠劑促創面愈合的機制。

1? 材料和方法

1.1 實驗動物與試劑：清潔級C57BL/6J雄性小鼠，6～8周齡，體質量（22±3）g，購自東南大學實驗動物中心。康復新凝膠劑參考羅誠等的方法[10]進行制備，林可霉素利多卡因凝膠劑（批號：160601）購自上海新亞藥業閔行有限公司，ELISA試劑盒、HE染色試劑購自上海碧云天生物研究所，免疫組化染色試劑購自北京中杉金橋公司，Trizol 試劑、Prime ScriptTM RT reagent Kit及SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒購自日本Takara公司，大鼠單克隆抗VEGF、兔單克隆抗 iNOS與兔單克隆抗CD206購自美國Abcam公司，HRP標記山羊抗兔IgG購自武漢谷歌生物科技有限公司，其他試劑均用國產分析純。

1.2 動物造模：C57BL/6J小鼠通過腹腔注射10%水合氯醛（0.3ml/100g）麻醉后，進行消毒處理，在小鼠背面脊梁兩側用無菌手術刀切直徑1.6cm大小的全層皮膚創面，深度達皮下深筋膜，切割后，無菌紗布壓迫止血，用凡士林油紗布覆蓋傷口，防止創面干燥，并使用醫用膠布固定。將小鼠獨籠飼養，期間自由飲水與進食。2d后小鼠出現精神萎靡，且背部創面有膿性分泌物，則表示造模成功。

1.3 動物分組與處理：將60只C57BL/6J小鼠隨機分成3組，分別為模型組、康復新凝膠劑組（凝膠劑組）、林可霉素利多卡因凝膠劑組（林可霉素組），每組20只。各組小鼠進行造模，造模成功后，生理鹽水擦洗小鼠創面，凝膠劑組和林可霉素組小鼠創面分別予以0.1ml康復新凝膠劑、林可霉素利多卡因凝膠劑處理，模型小鼠創面貼敷生理鹽水。每天換藥1次，直至處死。

1.4 創面愈合率測定：分別于治療后第3、7、10天檢測各組小鼠創面愈合情況，對小鼠的創面進行拍照，用Image-ProPlus軟件進行測定分析，計算創面愈合率。創面愈合率（%）=（原始創面總面積-未愈合創面面積）/原創面總面積×100%。

1.5 ELISA檢測血清中IL-6與TGF-β的含量：分別于治療后第3、7、10天各組小鼠心臟取血，血液在室溫下靜置30min，通過冷凍離心機中以3 500r/min離心15min，吸取上清。按小鼠IL-6與TGF-β ELISA試劑盒說明書操作步驟，于酶標儀450nm處測定OD值，計算IL-6與TGF-β含量。

1.6 組織學觀察：于治療后第10天處死各組小鼠，以創面為中心，距創面邊緣向外2mm切取組織。將組織分成兩半，一半放置于液氮后保存于-80℃，另一半以4%多聚甲醛固定，用于病理標本制作。創面組織經4%多聚甲醛固定后，進行常規石蠟包埋，制成厚度為4μm的切片，常規脫蠟水化后，進行HE染色：蘇木精染色5min，流水沖洗后，伊紅染色3min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，自然風干，中性樹膠封片，于光鏡下觀察組織中炎性細胞浸潤、新生毛細血管量、肉芽組織生成情況。

1.7 免疫組化檢測創面組織VEGF、iNOS與CD206表達：于治療后第10天檢測各組小鼠創面組織VEGF、iNOS與CD206的蛋白表達情況。創面組織經4%多聚甲醛溶液固定，常規石蠟包埋、切片后，進行常規脫蠟水化。放入抗原修復液中高溫下進行修復，室溫自然冷卻后PBS沖洗，并滴加3% H2O2作用20min，PBS再次洗滌后，滴加稀釋的大鼠單克隆抗VEGF（1：100）、兔單克隆抗iNOS（1：80）、兔單克隆抗CD206（1：200）為一抗，4℃下孵育過夜，次日PBS洗滌后，滴加對應的二抗工作液，在室溫孵育60min后，PBS沖洗，滴加DAB顯色3min，經蘇木素復染2min，梯度酒精脫水、二甲苯透明后，用中性樹脂封片，在光學顯微鏡下觀察并采集照片。

1.8 qRT-PCR檢測創面組織中IL-6、TNF-α、IL-10與TGF-β mRNA表達：根據RNA提取試劑盒提取創面組織總RNA，采用紫外分光光度法測定RNA的濃度和純度。利用反轉錄試劑盒Prime ScriptTM RT reagent Kit將提取的RNA 反轉錄為cDNA，qRT-PCR法檢測創面組織中IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β mRNA的表達情況，根據SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ說明書進行操作，以GAPDH為內參。反應條件為95℃ 30s（1個循環），95℃ 5s、60℃ 30s（40個循環）。采用2-ΔΔCt法來計算各基因mRNA的相對表達量。使用的引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.9 統計學分析：本研究采用SPSS 19.0統計軟件計算所得數據，實驗數據均以均數±標準差（x?±s）表示，兩組間均數比較采用t檢驗，多組間均數比較采用One-way ANOVA進行，P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1 康復新凝膠劑對創面愈合率的作用：分別于治療后第3、7、10天檢測各組小鼠創面愈合情況，結果如圖1、表2所示，第3天各組小鼠傷口開始愈合，林可霉素組和凝膠劑組小鼠的創面愈合率顯著高于模型組小鼠創面愈合率，差異有統計學意義（P<0.05）。給藥第7天，各組小鼠傷口均變小，與模型組比較，林可霉素組和凝膠劑組小鼠的創面愈合率顯著增加（P<0.05）。第10天各組小鼠創面愈合情況更明顯，林可霉素組和凝膠劑組創面基本愈合，模型組仍有痂皮，林可霉素組和凝膠劑組創面愈合率與模型組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。

2.2 各組小鼠血清中IL-6與TGF-β含量比較：各組小鼠血清中IL-6與TGF-β含量檢測結果如表3所示，第3、7、10天林可霉素組和凝膠劑組小鼠血清中IL-6含量較模型組小鼠顯著下降，同時TGF-β含量較模型組顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.3 各組小鼠創面組織觀察：HE染色結果顯示，損傷后第10天，模型組創面炎性細胞稀疏，肉芽組織形成較少，新生毛細血管量少;與模型組比較，林可霉素組和凝膠劑組創面表皮增厚，炎性細胞浸潤明顯，新生致密肉芽組織，有大量新生毛細血管形成。

2.4 各組小鼠創面組織VEGF表達比較：VEGF表達結果如圖4所示，模型組VEGF陽性細胞著色較淺，林可霉素組和凝膠劑組VEGF陽性細胞著色較深且分布廣，林可霉素組和凝膠劑組VEGF陽性表達率分別為（25.73±4.15）%、（29.48±4.14）%，較模型組VEGF陽性表達率[（8.41±1.62）%]顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.5 各組小鼠創面組織M1型和M2型巨噬細胞分泌的細胞因子表達比較：qRT-PCR檢測結果如表4所示，損傷第10天，林可霉素組和凝膠劑組IL-6、TNF-α mRNA表達水平較模型組顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05）;而IL-10與TGF-β mRNA表達水平顯著高于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.6 各組小鼠創面組織iNOS與CD206表達：免疫組化染色結果如圖5～6所示，林可霉素組和凝膠劑組iNOS陽性細胞分布稀疏、著色較淺，模型組iNOS陽性細胞分布較廣泛，著色較深，林可霉素組和凝膠劑組iNOS陽性細胞數顯著低于模型組iNOS陽性細胞數，差異有統計學意義（P<0.05）;模型組CD206陽性細胞的分布較為稀疏，林可霉素組和凝膠劑組CD206陽性細胞著色深且分布范圍廣，林可霉素組和凝膠劑組CD206陽性細胞數顯著高于模型組CD206陽性細胞數（P<0.05）

3? 討論

目前，各類因素導致的外傷性創面損傷的發生率越來越高。在創面愈合過程中，各級反應錯綜復雜而又相互協同，炎癥反應作為創面修復的第一階段，在組織受損后開始，過程涉及凝血級聯反應、炎癥途徑和免疫系統相關反應[3]。修復的第二階段發生在創傷后2～10d內，其特征是不同類型的細胞發生增殖和遷移以及血管的生成，該過程主要受血管內皮生長因子A和成纖維細胞生長因子2的調節[11]。毛細血管的擴散為成纖維細胞和巨噬細胞帶來營養和氧合作用，通過肉芽組織代替纖維蛋白基質，并形成角質成為細胞遷移的底物，直到恢復上皮屏障為止[12]。修復的第三階段為重塑過程，通常在損傷后2～3周內開始，可以持續1年以上，在此階段，大多數內皮細胞、巨噬細胞和成肌纖維細胞進入細胞凋亡期，導致纖維化腫塊[13]，其特征為膠原蛋白和其他細胞外基質蛋白的活力降低。

創面愈合率是評估創面愈合情況最直觀的指標。本研究結果表明，康復新凝膠劑作用下小鼠創面愈合率得以提高。肉芽組織由成纖維細胞和新生的毛細血管組合構成，在組織損傷修復過程中可填充于傷口部位，通過抵抗感染與包裹炎性滲出物來保護創面，從而在傷口愈合向組織重塑的過渡提供了有利條件[14]。本研究通過創面組織病理染色，觀察到在康復新凝膠劑治療下，小鼠創面炎性細胞浸潤明顯，有大量新生毛細血管形成，肉芽組織致密較厚，由此說明康復新凝膠劑促進了小鼠的創面修復。

巨噬細胞的特征在于其可塑性高，根據情況表現出不同的表型和功能。M1巨噬細胞具有促炎作用，可分泌促炎因子如IL-6、TNF-α，能夠促進T輔助細胞1（Th1）應答并具有抑制腫瘤活性的作用[15]。M2巨噬細胞有助于組織修復，分泌抑炎因子如IL-10、TGF-β以及生長因子VEGF等[16]。巨噬細胞向表型M1或M2的極化是一個動態且可逆的過程，在不同生理病理條件下會發生變化。在皮膚傷口愈合的階段，傷口部位炎癥反應過度，導致大量M1型巨噬細胞持續存在于傷口部位，并難以轉化為能夠促進愈合的M2型巨噬細胞，導致瘡面修復困難[17-19]。在本研究中，在康復新凝膠劑作用下，qRT-PCR結果顯示小鼠創面組織中IL-6、TNF-α mRNA表達水平降低，而IL-10與TGF-βmRNA表達水平升高。此外，免疫組化染色同樣顯示，iNOS陽性細胞數減少且CD206陽性細胞數增加，VEGF陽性表達率升高。這些結果均表明，康復新凝膠劑作用于創面后可促進巨噬細胞向M2型極化，同時抑制巨噬細胞向M1型極化，從而改善創面部位巨噬細胞表型異常的現象。

綜上所述，康復新凝膠劑可促進小鼠創面愈合，有利于創面肉芽組織與新生毛細血管的形成，其機制可能與促進巨噬細胞表型轉化相關。結合當前創面愈合困難的現狀，研發外用的愈合劑具有實用價值，本研究可為皮膚創面治療提供實驗依據，但目前康復新凝膠劑相關研究報道較少，其促進創面愈合的機制仍需進一步的深入研究，以期應用于臨床治療。

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[收稿日期]2020-06-22

本文引用格式：薛堯，展冠軍，馬靜.康復新凝膠劑對小鼠創面組織修復的作用及相關機制探討[J].中國美容醫學，2021，30（4）：110-114.