水母雪蓮多糖對UVB誘導的小鼠皮膚損傷保護作用的機制研究

曾智 孔悅 郭硯

[摘要]目的：探討水母雪蓮（Saussurea Medusa Maxim）多糖對中波紫外線（Ultraviolet B，UVB）誘導的小鼠皮膚損傷保護作用的機制研究，奠定其臨床應用理論基礎。方法：30只昆明種雄性小鼠隨機分為正常組、UVB組、UVB+水母雪蓮組三組。UVB組和UVB+水母雪蓮組皮下注射5% D-半乳糖10ml/（kg·d），同時每日UVB照射，持續(xù)造模40d;正常組正常光照飼養(yǎng)，每日皮下注射同體積生理鹽水。第11天開始，UVB+水母雪蓮組每日按劑量4g/（kg·d）灌胃水母雪蓮多糖，正常組、UVB組則每日灌胃等體積的生理鹽水。連續(xù)用藥30d后觀察小鼠皮膚組織形態(tài)學變化，測定皮膚含水量，檢測水通道蛋白3（AQP3）通路中表皮生長因子受體（EGFR），細胞外調節(jié)蛋白激酶（ERK），AQP3的表達。結果：光鏡下可見UVB+水母雪蓮組較UVB組表皮層變薄，真皮層增厚，纖維組織增多，排列緊密有序。UVB組EGFR和ERK的表達量高于正常組，AQP3表達量低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。UVB+水母雪蓮組EGFR和ERK的表達量低于UVB組，AQP3表達量高于UVB組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：水母雪蓮多糖能通過AQP3通路來減輕UVB導致的小鼠皮膚損傷。

[關鍵詞]水母雪蓮;皮膚光老化;水通道蛋白;膠原纖維;中波紫外線

[中圖分類號]R339.3+8? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）04-0102-04

The Protective Effect of Saussurea Medusa Maxim Polysaccharide on UVB Induced Skin Injury in Mice

ZENG Zhi1，KONG Yue1，GUO Yan2

（1.Graduate School of Qinghai University，Qinghai 810000，Xining，China;2.Department of Medical Cosmetology，Affiliated Hospital of Qinghai University，Qinghai 810000，Xining，China）

Abstract： Objective? To investigate the protective effect of Saussurea medusa Maxim polysaccharide on UVB induced skin injury in mice， and to lay the theoretical foundation for its clinical application. Methods? Thirty Kunming male mice were randomly divided into three groups， the normal group， the UVB group and the UVB+ Saussurea medusa group. Mice in the UVB group and the UVB+Saussurea medusa group were injected with 5% D-galactose 10ml/（kg?d）subcutaneously and subjected to UVB irradiation for 40d continuously. Mice in the normal group as fed under normal light and was subcutaneously injected with normal saline of the same volume every day. Starting from the 11th day of modeling， mice in the UVB+ Saussurea medusa group was gavaged with a dose of 4g/（kg?d）， mice in the normal group and the UVB group were gavaged with normal saline of the same volume daily respectively. After 30 days， skin histomorphological variation were observed， skin moisture content was measured， and expressions of epidermal growth factor receptor （EGFR）， extracellular regulatory protein kinase （ERK）， and aquaporin 3 （AQP3） in AQP3 pathway were detected. Results? Under light microscope， compared with the UVB group， the epidermis of the UVB+Saussurea medusa group was thinner， the dermis was thicker， and the fibrous tissue was more densely arranged and orderly. The expression of EGFR and ERK in the UVB group were higher than those in the normal group， and the expression of AQP3 was lower than that in the normal group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The expression of EGFR and ERK in the UVB+ Saussurea medusa group were lower than those in the UVB group， and the expression levels of AQP3 was higher than that in the UVB group （P<0.05）. Conclusion? The polysaccharide of Saussurea medusa Maxim can alleviate the skin injury of mice caused by UVB through AQP3 pathway.

Key words： Saussurea Medusa Maxim; skin photoaging; aquaporin; collagenous fiber; UVB

皮膚的光損傷主要是由中波紫外線（UVB）造成的[1-2]。UVB可使皮膚變得干燥、缺水，從而損害角質層功能，表現為皮膚粗糙、松弛、質地變硬、皺紋形成和傷口延遲愈合[3]。一旦沒有及時防范與治療，甚至發(fā)展為光化性角化病，最終導致皮膚鱗狀細胞癌[4]。

水母雪蓮是一種高原草本植物，為我國中藏藥中的稀有珍貴藥材。水母雪蓮中含有豐富的黃酮、木素、多糖等成分，具有優(yōu)秀的抗氧化能力，廣泛應用到抗炎、抗誘變和抗癌的治療中[5]。研究證實水母雪蓮（Saussurea Medusa Maxim）多糖能夠明顯恢復UVB輻射后人永生化表皮細胞（Hacat）形態(tài)[6]。AQP3是人體內重要的膜通道，選擇性地輸送水、甘油和其他化合物[7-8]，并且AQP3在傷口愈合中也扮演很重要的角色，促進角質形成細胞遷移，增強角質形成細胞的增殖和分化[9]。但目前水母雪蓮多糖通過AQP3通路對UVB誘導皮膚損傷保護作用機制相關研究尚未見文獻報道。本研究將進一步在動物水平探討水母雪蓮多糖對紫外線誘導小鼠皮膚損傷的保護作用及相關分子機制。

1? 材料和方法

1.1 實驗動物：小鼠，雄性，30只，健康的SPF級昆明種小鼠，45d齡，體重20～25g，購于西安科奧生物科技有限公司[SXXK（陜）2015-002]。飼養(yǎng)于青海省高原研究中心SPF級實驗室，實驗期間小鼠自由攝食飲水。

1.2? 實驗藥物：水母雪蓮多糖（瑞林生物科技，西安）。

1.3? 試劑：水合氯醛、D-半乳糖、強效RIPA裂解液（索萊寶，北京），聚氰基丙烯酸正丁酯（Butyleyanoacrylate， BCA）（賽默飛），HE染色試劑盒、Masson三色染色試劑盒（建成生物，南京），抗磷酸化細胞外調節(jié)蛋白激酶（Phospho-extracellular regulated kinase， P-ERK）抗體、抗細胞外調節(jié)蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases， ERK）抗體（Cell Signaling Technology），抗磷酸化表皮生長因子受體（Phospho-Epidermal growth factor receptor， P-EGFR）抗體，抗表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）抗體和抗水通道蛋白3（Aquaporin 3， AQP3）抗體（Abcam，美國），辣根過氧化物酶化學發(fā)光劑（Electrochemiluminescence， ECL）（默克密理博），辣根過氧化物酶標記二抗（索萊寶，北京）。

1.4 儀器：40W UVB紫外燈（德國PHILIPS，311～312nm），全波長酶標儀，UVB輻照度監(jiān)視器（路昌電子企業(yè)有限公司，臺灣）、電泳儀、化學發(fā)光成像儀均由青海大學附屬醫(yī)院中心實驗室提供。

1.5? 方法

1.5.1 動物分組造模：在室內環(huán)境溫度（22℃～25℃），相對濕度50%～70%環(huán)境下，遵從隨機分配的原則，將30只小鼠分為3組，每組10只：正常組，UVB組，UVB+水母雪蓮組。小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，開始給藥造模，所有小鼠背部用脫毛劑脫掉皮膚表面毛發(fā)，暴露約5cm×5cm大小的皮膚，每5d脫毛一次。UVB組與UVB+水母雪蓮組每日頸背部皮下注射5% D-半乳糖10ml/（kg·d）同時進行UVB照射[10]，具體方法如下：紫外線燈管（UVB）功率40W，照射前測光強度。在每次照射前，讓燈管先預熱15min，照射過程中每隔15min均輪換鼠盒位置，來確保每個籠子里小鼠接受的光強度一致，每次照射時間為40min，光源在小鼠正上方約40cm處，持續(xù)造模40d。正常組小鼠正常光照飼養(yǎng)，每日頸背部皮下注射同體積的生理鹽水。造模第11天開始，UVB+水母雪蓮組小鼠每天按照4g/（kg·d）的分量將水母雪蓮多糖灌入胃中，正常組與UVB組小鼠則每天灌胃等量的生理鹽水，連續(xù)用藥30d。

1.5.2 取材：實驗第42天，所有小鼠麻醉后，分離出背部的脫毛皮膚。一部分用于皮膚含水量的測定，一部分制作病理切片，用于HE染色和Masson染色;一部分皮膚-80℃保存進行后續(xù)實驗。

1.5.3 干燥法測定皮膚含水量：用濾紙盡量擦干小鼠皮膚，裁剪頸背部約1cm×1cm范圍左右的脫毛皮膚，將皮膚濕重準確稱量，然后放入80℃烘箱中，烘干12h，待水分基本散發(fā)后，取出，精密稱量皮膚干重，按照下列公式：皮膚含水百分率（%）=（濕重-干重）/濕重×100%，進行計算。

1.5.4 蛋白免疫印跡法檢測EGFR、ERK、AQP3的表達：分別收集不同組的小鼠背部皮膚組織，加入剛從4℃冰箱取出的RIPA裂解液，在4℃低溫的環(huán)境下，離心15min后取上清，用BCA法測定蛋白濃度。用蛋白上樣緩沖液配置蛋白體系后95℃煮10min，將樣品加入到配好的凝膠中進行電泳。電泳結束后，立即進行轉膜，再用脫脂奶粉室溫下封閉，Tris緩沖鹽溶液+Tween（Tris-buffered saline-Tween，TBST）洗膜3次，每次5min。加入一抗（抗ERK抗體，抗磷酸化ERK抗體，抗EGFR抗體，抗磷酸化EGFR抗體，抗AQP3抗體，抗GAPDH抗體）4℃孵育過夜后，TBST洗膜3次，每次5min，加入HRP標記的抗兔的IgG抗體孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min。此后按顯色試劑盒說明書操作顯色。使用Image J進行條帶分析。

1.5.5 免疫組化：將4μm石蠟切片經過二甲苯脫蠟，梯度無水乙醇脫水，3%過氧化氫孵育10min后，磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffer saline，PBS）清洗。血清封閉后，于AQP3抗體（抗體與抗體稀釋液稀釋體積比為1∶100）中4℃孵育過夜，抗兔IgG酶標抗體37℃孵育。辣根過氧化酶孵育后，二氨基聯苯胺（Diaminobenzidine，DAB）染色，蘇木素復染。制片后在10倍、40倍顯微鏡下隨機選取視野拍照。

1.6 統(tǒng)計學分析：采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行實驗數據的統(tǒng)計分析。計量資料以（x?±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結果

2.1 小鼠皮膚肉眼觀察：在造模第10天、第20天、第30天、第40天對三組小鼠背部裸露皮膚拍照，肉眼觀察結果如圖1所示，可發(fā)現隨著時間的推移，UVB組小鼠皮膚狀態(tài)逐漸變差，UVB+水母雪蓮組小鼠的皮膚狀態(tài)恢復正常。在同一時間，與正常組對比，UVB組經過照射后呈現出皮膚顏色變紅、松弛、明顯干燥、脫屑、粗糙，并且出現皺紋。UVB+水母雪蓮組較UVB組來說，皮膚完整光滑無皺紋，無紅腫和色素沉著，皮膚緊致，無脫屑、出血現象。

2.2 對小鼠皮膚含水量的影響：如圖2所示，與正常組比較，UVB組皮膚含水量明顯降低（65.28% vs 59.39%），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與UVB組比較，UVB+水母雪蓮組皮膚含水量明顯升高（59.39% vs 63.28%，P<0.05）。

2.3 小鼠皮膚組織HE染色結果：如圖3所示，可發(fā)現正常組，皮膚結構完整，光滑，排列緊密;UVB組較正常組，表皮層異常增厚，角質層脫落嚴重，真皮層膠原纖維及彈力纖維缺失、斷裂卷曲、結構松散、排列紊亂。相對于UVB組，UVB+水母雪蓮組表皮無異常增厚，角質層相對完整真皮層排列有序，無錯亂。

2.4 小鼠皮膚組織Masson染色結果：如圖4所示，可發(fā)現UVB組，表皮與真皮層界限模糊，真皮層厚度明顯變小，膠原纖維含量減少，甚至出現空洞;膠原纖維分布不均，含量減少，出現斷裂，排列紊亂。UVB+水母雪蓮組真皮層厚度正常，膠原纖維分布均勻，排列緊密整齊。

2.5 對小鼠水通道蛋白3通路的影響：如圖5所示，UVB組P-EGFR與P-ERK的蛋白表達量要高于正常組，AQP3的表達量低于正常組;UVB+水母雪蓮組P-EGFR與P-ERK的表達量低于UVB組，AQP3的表達量高于UVB組。

2.6 免疫組化：如圖6～7所示，UVB組AQP3的陽性表達區(qū)域明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;UVB+水母雪蓮組AQP3的陽性表達區(qū)域高于UVB組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3? 討論

青海省作為中國的高海拔地區(qū)，紫外輻射極強，當地居民長期生活在此環(huán)境中抵抗力低，受到紫外線直接照射后，容易引起一系列的疾病，尤其是光損傷性皮膚病。簡便，有效的預防與治療方法是人們迫切需要的[11-12]。水通道蛋白（AQPs）是促進水通過細胞膜的通道，其中AQP3是皮膚中最豐富的AQP，在表皮的棘層和基底層大量表達，起著水和甘油轉運蛋白的作用[13]。AQP3運輸的甘油在角質層水化中發(fā)揮重要作用，通過促進各種脂類的生物合成，改善屏障功能和加強皮膚修復能力，所以筆者通過AQP3通路治療光老化損傷是一種新的嘗試。

本實驗通過注射D-半乳糖和UVB照射的聯合作用下，最大限度地制作了小鼠皮膚衰老模型[14]。經過水母雪蓮多糖治療的UVB+水母雪蓮組小鼠，皮膚較UVB組損傷小，皮膚色澤均勻，光滑不粗糙，無脫屑，結痂等癥狀，皮膚含水量提升明顯。在HE染色下，UVB+水母雪蓮組的表皮層與真皮層界限清晰，表皮無異常增厚，且恢復了真皮層正常厚度。在Masson染色下，UVB+水母雪蓮組小鼠膠原纖維與彈性纖維，排列整齊，缺失與斷裂情況大幅度降低。這證實了水母雪蓮多糖能有效修復皮膚真皮與表皮層的損傷。

據國內外相關研究發(fā)現，紫外線照射可以通過活化大量ERK，減少AQP3來損傷皮膚組織，造成皮膚光老化[15]。本實驗結果顯示經過處理后的UVB組，EGFR磷酸化而激活，進而激活ERK引起一系列皮膚氧化損傷，導致膠原蛋白等降解，皮膚屏障功能衰退。同時AQP3的表達在皮膚的棘層與基底層也降低，使皮膚含水量降低，皮膚穩(wěn)態(tài)失衡，傷口的愈合能力顯著下降。UVB+水母雪蓮組EGFR與ERK的表達水平低于UVB組，AQP3的表達水平高于UVB組，得到了很好的恢復。這更加證明了藥物有很好的療效。水母雪蓮多糖通過使EGFR，ERK的減少，AQP3的增多抵御了皮膚的衰老與損傷。但是這個結論和部分學者[16-17]的結論有些許出入，ERK到AQP3通路的具體機制還不清晰，特別是在皮膚組織上的相關信號通路還有待鉆研。如今，對于光老化方面的研究越來越多，但是對更加深入的具體機制研究尚且不足，這個也是后續(xù)研究要去努力探索的方向。

水母雪蓮多糖通過抑制ERK活性，上調AQP3的表達量與活性，從而改變皮膚表皮與真皮層厚度、纖維形態(tài)來起到治療皮膚衰老，加強皮膚屏障功能作用，且AQP3在防御皮膚光老化方面起到了重要作用。作為人類使用的光老化預防劑，植物抗氧化劑和天然化合物受到了相當大的關注，本次研究也為防紫外線藥物的研發(fā)提供了新的方向與實驗基礎。

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[收稿日期]2020-11-09

本文引用格式：曾智，孔悅，郭硯.水母雪蓮多糖對UVB誘導的小鼠皮膚損傷保護作用的機制研究[J].中國美容醫(yī)學，2021，30（4）：102-106.