羽脈山黃麻叢枝植原體的分子鑒定及病害調查*

萬瓊蓮 王連春 王 泉 許杏萍 蘇 帆 趙 靜 蔡 紅

(1.玉溪師范學院化學生物與環境學院 玉溪 653100； 2.云南農業大學農業生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室 昆明 650201)

羽脈山黃麻(Tremalevigata)屬榆科(Ulmaceae)山黃麻屬植物，是裸巖山地綠化的先鋒樹種(鄭昌隆， 2002； 楊超本， 2013)。據《中國植物志》記載，我國山黃麻屬植物有6種1變種，云南有5種，其中羽脈山黃麻可生長在向陽山坡雜木林或灌叢中，也可生長于干熱河谷疏林中，海拔在150～2 800 m(陳煥鏡等， 1998)。山黃麻速生，適應能力強，有造林、植被恢復、藥用等多種用途，具有較高生態價值、經濟價值和社會意義(劉剛等， 2006； 劉永剛等， 2014； 李媛等， 2003)。近幾年發現云南省玉溪市新平縣出現了羽脈山黃麻叢枝病，枝葉呈“鳥窩狀”，嚴重影響植物生長，甚至引起樹木死亡。

植原體(Phytoplasma)屬于原核生物界(Prokaryotae)柔膜菌綱(Mollicutes)植原體屬(CandidatusPhytoplasma)(劉仲健等， 1999)，寄生于植物韌皮部，感病植株最典型癥狀是叢枝、花變葉、花變綠，此外是節間縮短、小葉、黃化、枯枝(梢)、使植株長勢衰退和死亡(于少帥等， 2016)，主要通過韌皮部取食的葉蟬、飛虱、木虱等昆蟲傳播，尤其是葉蟬和蠟蟬類(盧恒宇等， 2016),對農林業生產造成嚴重危害，至少影響1 000種植物，其中我國報道了100多種(McCoyetal.， 1989)。目前植原體的分類主要依據16S rRNA基因(Leeetal.， 1998)進行，根據模擬RFLP圖譜的比較和相似系數的計算，目前將植原體分為33個16Sr組和超過100個亞組(Weietal.， 2007； Bertaccinietal.， 2014)。

本研究調查該叢枝病病害發生情況及危害程度；采用分子生物學方法對云南省玉溪市新平縣采集到的具有典型叢枝癥狀的羽脈山黃麻感病植株進行植原體檢測鑒定，以明確其病原及相關株系的分類地位，同時為植原體的深入研究以及本地區林業病害的防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 病害調查及發病區域數據采集 根據發病區域確定調查地點為云南省玉溪市新平縣哀牢山自然保護區東側至新平彝族傣族自治縣干熱河谷地區省道S306沿線，45 km 地帶，海拔在1 500～400 m之間。該地地勢復雜，屬山坡地帶，因此在該區域內沿主干道進行調查，調查時間選在山黃麻植原體病害盛發期7—8月，采用隨機調查的方法選取9個點，每點調查10株樹，共90株樹，統計其發病率，根據病害危害程度不同分為輕度(+)、 中度(++)和重度危害(+++)。

1.2 羽脈山黃麻植原體感病植株總DNA的提取 采自云南省玉溪市新平縣海拔1 200 m表現典型叢枝小葉癥狀的羽脈山黃麻感病植株。參照“百泰克”新型快速植物基因組DNA提取試劑盒(目錄號為DP3112)的方法提取植株總DNA，提取樣品于-20 ℃下冷凍保存備用。

1.3 PCR擴增、克隆與測序 針對植原體16 S rRNA基因采用植原體通用引物P1/P7 (P1∶5′-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3′;P7∶5′-CGTCCTTCATCGGCTCTT-3′)及R16F2n/R16R2[(R16F2n:5′-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3′; R16R2∶5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3′](Schneideretal.， 1995； Leeetal.， 1993)進行巢式PCR 擴增。將提取的總DNA稀釋25倍后擴增，直接PCR擴增反應循環： 94 ℃預處理5 min； 94 ℃ 1 min，48 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環； 72 ℃延伸10 min。巢式PCR以直接PCR擴增產物的25倍稀釋產物為模板： 95 ℃預處理5 min； 95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 30 s，35個循環； 72 ℃延伸10 min。用OMEGA的Cycle Pure Kit(D6492)試劑盒對PCR產物純化加A(TaKaRa TaqTM,R001A)，與pMD19-T (TAKARA) 載體連接后，轉化到大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α (全式金，CD201-01)中，菌落PCR反應篩選陽性克隆后由上海鉑尚生物技術有限公司進行序列測定。

1.4 序列在線分析與系統進化樹的構建 將測序所得DNA序列在GenBank中進行BLAST比對，確定是否為植原體。再通過植原體在線分類鑒定工具iPhyClassifier(https:∥plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgi-bin/resource/iphyclassifier.cgi)針對植原體16S rDNA F2nR2擴增片段進行相關候選種(‘CandidatusPhytoplasma’species)的確定及基于17種限制性內切酶的虛擬RFLP圖譜及相似系數(similarity coefficient，F)的16Sr組/亞組的確定，iPhyClassifier將序列相似性<97.5%以及RFLP模型相似系數F≤0.85的序列劃分為不同的組，0.85

2 結果與分析

2.1 感病植株的癥狀 感病植株和健康植株明顯不同，表現為植原體病害典型的叢枝和小葉癥狀，叢枝狀枝條大量密集叢生，遠看呈“鳥窩狀”，且節間縮短，葉片卷曲畸形、變小和黃化(圖1)。

2.2 羽脈山黃麻叢枝病病害調查 羽脈山黃麻在云南玉溪各縣廣泛存在，據前期調查發現云南玉溪新平縣和峨山縣都有羽脈山黃麻叢枝病的發生。新平縣發生區域主要位于哀牢山自然風景保護區東側至新平彝族傣族自治縣干熱河谷地帶，沿省道S306大約45 km 范圍內，從表1可以看出具體地理坐標在101°35′—101°53′E和23°56′—24°20′N之間，海拔從1 426～488 m，但發病區域主要集中在低海拔600～400 m之間，發病區域植被較為茂盛。該處山黃麻近3年都發現有叢枝病發生， 2018年7月調查此叢枝病平均發病率為38.9%，危害程度以中度(++)為主，發病樹枝癥狀明顯，嚴重影響植物的生長。該區域接近新平縣最低海拔，屬于河谷高溫區，由此可知，高溫地區可能有利于植原體病害的發生。

表1 羽脈山黃麻叢枝病調查區域地理位置及其發病率①Tab.1 Geographical location of survey area and incidence of Trema levigata witches’-broom disease

2.3 16S rDNA 片段 PCR 擴增結果 分別以山黃麻健康和感病植株提取的總 DNA 為模板，經巢式 PCR 擴增，結果感病植株獲得約1 200 kb 的16S rDNA 片段，健康植株未擴出特異性條帶(圖2)，說明感病植株中含有植原體，將該株系命名為云南玉溪羽脈山黃麻叢枝植原體(Tremalevigatawitches’-broom phytoplasma，TLWBYN01)。

圖2 山黃麻叢枝植原體16S rDNA 巢式PCR擴增電泳檢測Fig. 2 PCR products of 16S rDNA amplified from Trema levigata witches’-broom disease plantsM： 2 000 bp maker； 1-3： 感病植株； 4： 健康植株。Lane 1-3: Diseased plants; Lane 4: Healthy plant.

2.4 16S rDNA序列分析及系統進化樹構建 將擴增到的約1 200 bp大小的16S rDNA特異片段克隆測序，結果表明： 該16S rDNA基因擴增片段含有1 246個核苷酸，G + C 的含量為47.11%，TLWBYN01在GenBank中登錄號為： MN513329。利用GenBank 中的BLAST程序對所得16S rDNA序列進行同源性檢索，發現該序列與植原體16S rDNA序列相似度最高。通過植原體在線分類軟件iPhyClassifier得出TLWBYN01與翠菊黃化植原體(CandidatusPhytoplasma asteris，M30790)序列相似性達99.8%，因此該植原體為‘CandidatusPhytoplasma asteris’相關菌株，屬于16Sr I組成員。通過MegaX軟件構建TLWBYN01的16S rDNA系統進化樹(圖3)，從進化樹可看出TLWBYN01與16S rI組明顯聚為一個分枝，屬16S rI組成員。通過iPhyClassifier虛擬RFLP分析及相似系數(similarity coefficient，F)計算可知TLWBYN01與16S rI-X亞組的參考株系番木瓜束頂植原體(JF781308)最為相似，相似系數F為0.98。由圖4可知，TLWBYN01與16S rI-X(JF781308)的17種限制性內切酶的酶切圖譜除了MseI以外其余相同。因此TLWBYN01屬于16S rI-X亞組的一個變種16S rI-X**。此外，通過在線分析軟件MUSCLE比較得出TLWBYN01與16S rI-X亞組成員番木瓜束頂植原體(JF781308)和印度葫蘆植原體(LT594117、LT594118)同源性分別為99.2%和99.6%。

圖3 利用鄰接法構建的基于16S rRNA基因的系統發育樹Fig. 3 Phylogenetic tree constructed using the neighbour-joining method based on 16S rRNA gene sequences草莓果變綠Strawberry phylloid fruit;三葉草變葉Clover phyllody;翠菊黃化叢枝AY Witche’s broom;杜鵑花小葉Azalea little leaf; 月見草綠化Oenothera virescence; 墨西哥馬鈴薯紫頂Mexican potato purple top; 葫蘆黃化小葉Lagenaria siceraria yellow little leaf; 番木瓜束頂Papaya bunchy top; 植原體候選種Ca.phytoplasma.

圖4 虛擬16S rDNA-RFLP酶切圖譜Fig. 4 Virtual RFLP analyses of TLWBYN01 phytoplasmas 16S rDNA F2nR2 fragmentA、B: TLWBYN01和JF781308的17種限制性內切酶虛擬RFLP分析；C：16S rI亞組MseI虛擬RFLP分析。A,B:Virtual RFLP analysis of TLWBYN01 and JF781308 with 17 restriction enzymes. C: Virtual RFLP analysis of 16S rI subgroups with restriction enzymes MseI.

3 討論

本研究發現的植原體病害寄主為榆科山黃麻屬植物羽脈山黃麻，榆科榆屬植物已有植原體病害相關報道(朱天生等， 2008)，但榆科山黃麻屬植物還未見有關植原體病害的報道，因此羽脈山黃麻為植原體的又一新寄主。羽脈山黃麻叢枝病發生于云南新平縣境內哀牢山自然風景保護區東側的干熱河谷地帶，海拔1 500 m以下，發病主要集中在400～600 m的低海拔高溫地區，且連續3年都觀察到該病的發生，癥狀較為明顯，嚴重影響植物生長，有的甚至整株枯死， 2018年7月調查得知其平均發病率為38.9%，危害程度中度。說明此植原體病害在該區域可能是一種常發病害，加之此處山黃麻分布較為廣泛，在條件適宜的情況下，該病害可能會擴散，山黃麻屬于綠化先鋒物種，應給予一定保護，使其避免受病害危害。前期有研究表明植原體病害的發病與溫度相關，溫度高容易引發植原體病害，且在溫度較高的7、8月份是病害高發期(范國權等， 2015)，本次調查與前期研究相符。此外先前在云南元謀發現的多種植原體病害(萬瓊蓮， 2017)，也位于南亞熱帶干熱季風氣候地區，年平均氣溫相對較高，說明高溫有利于植原體病害的發生。

本研究基于16S rRNA基因明確了羽脈山黃麻叢枝植原體(TLWBYN01)的分類地位，該植原體與CandidatusPhytoplasma asteris相關，屬16S rI-X亞組的變種，與已報道的榆科榆屬相關植原體(16S rV-A)不同(Leeetal., 2004； 朱天生等， 2008)。已知全世界范圍內分布最為廣泛的是翠菊黃化組(16S rI組)植原體，16S rI組也是我國最主要的植原體之一，組內多樣性也最為豐富(Leeetal.， 2004； 賴帆等， 2008)，但有關16S rI-X亞組的序列報道還相對較少，因此本研究可為本亞組及16S rI組的研究奠定基礎。植原體不同于其他可培養細菌，它還需要大量數據來進行進一步的分析和完善，這對于植原體的研究具有重要意義。除了分析羽脈山黃麻植原體16S rRNA 基因序列，還可以進一步分析它的其他保守基因，因為相較16S rRNA 基因，其他基因有更大的變異性，有利于植原體的系統分析和鑒定。最早是針對rp、tuf和secY基因對各組植原體進行更細致地劃分(朱天生等， 2007)，而后還加入了secA、ipt、dnaK、fusA、gyrB、pyrG和rpoB等基因，得到多個基因序列后，采用多位點序列分析法對組內的植原體進行更為全面的遺傳變異規律和系統發育的研究，這在16S rI組內已得到應用(Yuetal.， 2017)。這是首次在羽脈山黃麻上發現植原體，且該叢枝病發生穩定，有一定的發病群體，值得進一步研究，后續可通過多位點序列分析法對其進行完善。在調查過程中也有發現疑似媒介昆蟲葉蟬，因此可以進一步調查其媒介昆蟲。對該病害的研究，可幫助我們了解植原體以及它與寄主之間的相互關系。

4 結論

云南玉溪新平縣發現的羽脈山黃麻叢枝病對植物生長產生了嚴重影響，經調查表明該病害位于大約101°35′—101°53′E和23°56′—24°20′N之間，集中在低海拔400～600 m的溫度相對較高的干熱河谷地區，常年危害， 2018年7月調查得知平均發病率為38.9%，危害程度中等，但因該區域植被茂盛，山黃麻分布廣泛又是先鋒物種，因此要注意進行動態監測，加強對該病害的防控，以免擴散傳播。羽脈山黃麻叢枝病經分子鑒定屬于植原體病害，該植原體與CandidatusPhytoplasma asteris相關，屬16S rI-X亞組的變種。山黃麻為植原體新寄主。