白血病抑制因子抑制缺氧缺血新生大鼠模型神經元凋亡的機制研究

湯麗萍,閆 瑾,王 浩,范 芳*

(1空軍軍醫大學西京醫院兒科,西安 710032;2西安醫學院醫學技術學院;*通訊作者,E-mail:76709358@qq.com)

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopatly,HIE)可引起神經炎癥,并導致神經元凋亡并進一步加重腦損傷。小膠質細胞和星形膠質細胞是神經炎癥的主要因子[1]。尤其是小膠質細胞活化和富集是缺氧缺血的病理特征。激活的小膠質細胞產生多種細胞毒因子觸發神經炎癥并引起神經元功能障礙[2]。

白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)是白細胞介素6細胞因子家族中的一種糖蛋白,在中樞神經系統,LIF主要由星形膠質細胞釋放,可促進神經活動增加、少突膠質細胞分化和神經元存活[3]。據報道,在新生兒腦梗死后,LIF的表達顯著增加,LIF通過誘導信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)磷酸化以及Delta-like-1和Notch1的表達來調節新生兒腦缺血急性恢復期間神經前體細胞的擴張[4]。然而,目前尚不清楚LIF對HIE損傷后的神經保護機制。

核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)[5]和核轉錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)[6]是與腦缺血后小膠質細胞活化和隨后的炎癥反應相關的關鍵轉錄因子。NF-κB部分依賴于NLRP3炎癥體的調節,并共同參與神經炎癥過程。適當抑制NLRP3炎癥體和NF-κB p65核轉位可以有效抑制缺血后小膠質細胞的激活和神經炎癥[7]。

目前,關于LIF在新生大鼠HIE模型中調節神經元凋亡的機制尚不明確。因此,本研究旨在從NLRP3和NF-κB信號通路介導的神經炎癥方面來揭示LIF在HIE發病過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

過表達LIF的慢病毒(LV-LIF)和對照慢病毒(LV-NC)購自上海吉瑪制藥技術有限公司。2,3,5-三苯基四氮唑氯(TTC)購自美國Sigma-Aldrich公司;尼氏染色和TUNEL染色試劑盒購自瑞士羅氏公司;Trizol、Prime Script TM RT Reagent試劑盒、SYBR PreMix Ex Taq Ⅱ購自日本Takara Biotechnology公司;核質蛋白提取試劑盒、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;BCA蛋白分析試劑盒購自碧云天生物技術研究所;Alexa Fluor 488-偶聯山羊抗鼠IgG購自美國Proteintech公司,其余抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司;增強的化學發光(ECL)試劑盒購自美國Bio-Rad公司;DAPI購自美國Sigma公司。

1.2 實驗動物

90只7日齡SPF級Sprague-Dawley(SD)新生大鼠由西安醫學院[SYXK(陜)2016-004]提供,體質量16-20 g,雌雄不限。大鼠在12 h的光/暗周期、21-24 ℃、55%相對濕度的環境下飼養,由母鼠自由哺乳。

1.3 新生大鼠缺氧缺血誘導模型

將新生大鼠置于溫控室中,用乙醚進行全身麻醉誘導。新生大鼠被固定在一個立體定向器中,暴露右側頸總動脈,分離神經和靜脈,用5-0絲線結扎頸總動脈,縫合傷口。1 h后,將新生大鼠暴露在37 ℃的低氧密封室(92% N2和8% O2)中2 h。結束后,將新生大鼠送回母鼠籠中。假手術大鼠僅暴露頸總動脈,但不結扎總動脈,也不低氧處理。

1.4 動物分組及處理

在HIE建模前7 d,對50只新生大鼠腦室注射過表達LIF的慢病毒(LV-LIF)或對照慢病毒(LV-NC)。大鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉,在右側大腦半球鉆孔,將10 μl注射器立體定向插入為腦室注射準備的孔中。右側大腦半球分別注射5 μl LV-LIF(1×109TU/ml)或LV-NC(1×109TU/ml),注射速率為0.5 μl/min。LV-LIF或LV-NC給藥及HIE建模后,根據處理方法將新生大鼠分為以下4組:假手術組(n=15):僅進行假手術;HIE組(n=15),僅進行HIE建模;HIE+LV-NC組(n=15):在HIE模型大鼠基礎上進行LV-NC腦內給藥;HIE+LV-LIF組(n=15):在HIE模型大鼠基礎上進行LV-LIF腦內給藥。

1.5 梗死體積檢測

建模48 h后分離腦組織,在-20 ℃冰凍20 min后,連續冠狀切片5片(2 mm厚),然后將切片孵育在37 ℃下用2% 2,3,5-三苯基四氮唑氯(TTC)染色25 min。用Image J軟件分析梗死體積。

1.6 神經行為評估

根據Longa評分[8]進行神經行為評估,用Longa評分檢測神經功能缺損程度。0分,無明顯缺陷;1分,左前爪不能充分伸展;2分,左前肢伸展困難,向左轉圈;3分,向左傾倒;4分,不能自發行走,意識水平下降。得分越高,損害越嚴重。2分和3分的動物納入研究中,而得分為0,1,4分的HIE新生大鼠則被排除在外。

1.7 尼氏染色和TUNEL染色檢測大鼠腦細胞凋亡

建模48 h后,用水合氯醛麻醉新生大鼠,快速移出大腦,在4 ℃下4%多聚甲醛固定。冠狀切開腦組織,厚度為4 μm。根據制造商的說明對切片進行尼氏染色和TUNEL染色。每組隨機選擇5片,并用OLYMPUS CKX41顯微鏡分析。通過Image J軟件計算細胞凋亡指數(AI)。AI=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.8 RT-PCR檢測大鼠腦組織LIF mRNA表達水平

用Trizol提取腦組織總RNA,用Prime Script TM RT Reagent試劑盒逆轉錄成cDNA。在Bio-Rad Q5實時熒光定量PCR儀上使用SYBR PreMix Ex Taq Ⅱ進行PCR。循環條件包括95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,共40個循環。引物序列如下所示:LIF正向:5′-TGCTCTGGCTTTAGTGGAAAATATG-3′,反向:5′-CTCTTAGGAGTGGATAGTCAGTCCG-3′;β-actin正向:5′-TGACGACCATTCTGACAGGA-3′,反向:5′-GTGTGGGTGAACTCAGGTAA-3。

1.9 Western blot檢測LIF、NLRP3、ASC、Caspase-1、NF-κB p65和IκBα蛋白表達水平

取缺血半影區的腦組織。通過核質蛋白提取試劑盒提取蛋白質。用BCA蛋白分析試劑盒檢測蛋白的濃度。用10%SDS-PAGE電泳分離總蛋白(50 μg),并轉移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h,并用以下一抗在4 ℃孵育過夜:抗LIF(1 ∶2 000)、抗NLRP3(1 ∶2 000)、抗ASC(1 ∶2 000)、抗Caspase-1(1 ∶1 000)、抗NF-κB p65(1 ∶2 000),抗IκBα(1 ∶2 000)、抗Lamin B1(1 ∶1 000)和抗β-actin(1 ∶1 000)兔單克隆抗體。用TBST洗滌3次后,用辣根過氧化物酶標記的特異性二抗在37 ℃孵育1 h,通過增強的化學發光(ECL)試劑盒顯影。Lamin B1作為細胞核蛋白內參,β-actin作為細胞質蛋白內參。

1.10 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測大鼠腦組織勻漿中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平

用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒測定腦組織勻漿中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-6(IL-6)的水平。

1.11 免疫熒光試驗檢測大鼠腦切片中Iba-1的表達

腦切片在室溫下用4%甲醛溶液固定30 min,用1% Triton X-100孵育30 min,用5%山羊或驢血清在37 ℃封閉1 h,然后用以下一抗在4 ℃孵育過夜:Iba-1(1 ∶200)。用PBS洗滌3次后,切片與Alexa Fluor 488-偶聯山羊抗鼠IgG(1 ∶200)熒光二抗在37 ℃反應1 h。用DAPI(1 ∶200)在37 ℃染色10 min。所有圖像均使用尼康A1R/A1激光共聚焦顯微鏡觀察和獲取。

1.12 數據統計學分析

使用IBM SPSS 19.0軟件進行數據分析,結果表示為平均值±標準差。使用單因素方差分析及LSD檢驗進行組間比較。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 LIF在HIE新生大鼠腦組織中的表達

與假手術組相比,HIE組大鼠LIF的mRNA和蛋白表達水平均顯著增加(P<0.05)。與HIE組和HIE+LV-NC組相比,HIE+LV-LIF組過表達LIF的慢病毒給藥后大鼠LIF mRNA和蛋白的表達水平均升高(P<0.05),HIE組與HIE+LV-NC組的LIF mRNA和蛋白的表達水平無顯著差異(P>0.05,見圖1)。

A.Western blot檢測LIF蛋白的表達B.RT-PCR檢測LIF mRNA的表達與假手術組比較,*P<0.05;與HIE組比較,#P<0.05;與HIE+LV-NC組比較,&P<0.05圖1 LIF在不同干預的新生大鼠腦組織中的表達Figure 1 Expression of LIF in the brain tissue of newborn rats after different treatment

2.2 過表達LIF對HIE新生大鼠的神經行為的影響

假手術組新生大鼠的神經功能缺損評分為0分,說明該組大鼠無明顯神經缺陷。HIE組和HIE+LV-NC組新生大鼠的神經功能缺損評分分別為2.7±0.5分和2.6±0.3分。與HIE組和HIE+LV-NC組相比,HIE+LV-LIF組的神經功能缺損評分(1.5±0.4)顯著降低(P<0.05,見圖2)。

與假手術組比較,*P<0.05;與HIE組比較,#P<0.05;與HIE+LV-NC組比較,&P<0.05圖2 新生大鼠的神經功能缺損評分Figure 2 Neurological deficit score of newborn rats after different treatment

2.3 過表達LIF對HIE新生大鼠腦梗死體積的影響

TTC染色結果顯示,假手術組新生大鼠無腦梗死區域,HIE組和HIE+LV-NC組的腦梗死體積分別為27.6%±3.1%和26.8%±3.1%。與HIE組和HIE+LV-NC組相比,HIE+LV-LIF組大鼠的腦梗死體積(14.8%±2.6%)顯著降低(P<0.05,見圖3)。

2.4 過表達LIF對HIE新生大鼠神經元凋亡的影響

尼氏染色結果顯示,與假手術組相比,HIE組梗死區空泡化、神經元丟失和組織破壞增加;與HIE組和HIE+LV-NC組相比,HIE+LV-LIF組的空泡化、神經元丟失和組織破壞明顯減輕。TUNEL染色結果顯示,與假手術組相比,HIE組細胞凋亡指數增加(P<0.05);與HIE組和HIE+LV-NC組相比,HIE+LV-LIF組的細胞凋亡指數明顯降低(P<0.05,見圖4,5)。

圖4 新生大鼠腦組織的尼氏染色和TUNEL染色Figure 4 Nissl staining and TUNEL staining of neonatal rat brain tissue

與假手術組比較,*P<0.05;與HIE組比較,#P<0.05;與HIE+LV-NC組比較,&P<0.05圖5 TUNEL染色評估新生大鼠海馬和皮層的細胞凋亡指數Figure 5 Apoptosis index of hippocampus and cortex of newborn rats by TUNEL staining

2.5 過表達LIF對HIE新生大鼠神經炎癥的影響

與假手術組相比,HIE組新生大鼠腦組織勻漿中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平均升高(P<0.05);與HIE組和HIE+LV-NC組相比,HIE+LV-LIF組腦組織勻漿中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平均降低(P<0.05,見圖6)。

與假手術組比較,*P<0.05;與HIE組比較,#P<0.05;與HIE+LV-NC組比較,&P<0.05圖6 新生大鼠腦組織勻漿中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平Figure 6 The levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in the brain homogenate of newborn rats

2.6 過表達LIF對HIE新生大鼠小膠質細胞活化的影響

與假手術組相比,HIE組新生大鼠腦組織中Iba-1的相對熒光強度顯著升高(P<0.05);與HIE組和HIE+LV-NC組相比,HIE+LV-LIF組腦組織中Iba-1的相對熒光強度顯著降低(P<0.05,見圖7)。

與假手術組比較,*P<0.05;與HIE組比較,#P<0.05;與HIE+LV-NC組比較,&P<0.05圖7 新生大鼠腦組織中Iba-1的免疫熒光染色Figure 7 Immunofluorescence staining of Iba-1 in the brain tissue of newborn rats

2.7 LIF對HIE新生大鼠腦缺血半影區內NLRP3和NF-κB信號通路的影響

與假手術組相比,HIE組大鼠腦缺血半影區內NLRP3、ASC和Caspase-1的蛋白表達水平均升高(P<0.05);與HIE組和HIE+LV-NC組相比,HIE+LV-LIF組大鼠腦缺血半影區內NLRP3、ASC和Caspase-1的蛋白表達水平均降低(P<0.05,見圖8)。與假手術組相比,HIE組大鼠腦缺血半影區內NF-κB p65的蛋白表達水平升高,而IκBα的蛋白表達水平降低(P<0.05);與HIE組和HIE+LV-NC組相比,HIE+LV-LIF組大鼠腦缺血半影區內NF-κB p65的蛋白表達水平降低,而IκBα的蛋白表達水平升高(P<0.05,見圖9)。

與假手術組比較,*P<0.05;與HIE組比較,#P<0.05;與HIE+LV-NC組比較,&P<0.05圖9 新生大鼠腦缺血半影區中NF-κB p65和IκBα的蛋白表達Figure 9 Protein expression of NF-κB p65 and IκBα in the penumbra of cerebral ischemia in neonatal rats

3 討論

白血病抑制因子是一種多功能的高度糖基化蛋白,在體內多器官和組織中合成和分泌,參與內分泌、生殖、炎癥和免疫系統的許多重要生物學功能,并在中樞神經系統中作為神經營養因子發揮作用[4]。LIF通過與其受體以及糖基化的gp130蛋白復合物結合,激活多條下游信號通路。根據組織類型、細胞和發育階段的不同,LIF可以激活和調節各種類型的信號通路,包括JAK/STAT3、PI3K/AKT和MAPK信號通路[9-11]。在正常組織中,LIF的轉錄水平很低,但在損傷后其表達顯著增加[12]。有研究顯示,在LIF單倍體缺陷小鼠中,LIF缺陷小鼠有更嚴重的運動和感覺缺陷,伴隨著細胞死亡和軸突變性增加[12]。Gresle等[13]發現LIF基因缺失的小鼠更容易患實驗性自身免疫性腦脊髓炎。然而,LIF在HIE中的作用仍不明確,本研究顯示,LIF在HIE新生大鼠模型腦內上調。為了進一步揭示LIF在HIE中的作用機制,本研究對HIE新生大鼠腦內注射了過表達LIF的慢病毒。發現過表達LIF改善了HIE新生大鼠的神經行為并減少了腦梗死體積,說明LIF密切參與HIE的發病過程。

缺氧減少了葡萄糖和氧氣的輸送,從而引起細胞呼吸紊亂和代謝異常并導致氧化應激和自由基的產生,進一步誘導炎癥介質釋放,導致血腦屏障的破壞和繼發性腦損傷[14]。繼發性神經元損傷與以小膠質細胞和星形膠質細胞激活為特征的神經炎性反應有關,而過度的神經炎癥也是神經元凋亡的主要原因。因此,抑制HIE中的神經炎癥是減少神經元死亡及疾病進展的關鍵。本研究表明,過表達LIF可有效抑制神經炎癥及神經元凋亡。

小膠質細胞是中樞神經系統中介導腦缺血后神經炎癥的主要免疫細胞[15],負責監測中樞神經系統的微環境[16]。當腦內缺氧缺血后,小膠質細胞會經歷一系列的表型變化轉變成具有較少和較厚突起或變形蟲形狀的活化細胞形態[17]。一方面,活化的小膠質細胞遷移到缺血區,清除有害物質并維持組織穩態。另一方面,活化的小膠質細胞產生過量的炎性細胞因子、趨化因子和氧/氮自由基加劇組織損傷和神經元死亡[18]。因此,抑制小膠質細胞的過度激活可以抑制神經炎癥并預防腦損傷。本研究顯示,過表達LIF可明顯抑制活化的小膠質細胞標志物Iba-1的表達。因此,上述結果提示LIF可能通過抑制HIE引起的小膠質細胞活化來減輕神經炎癥。

NLRP3炎癥體主要包括NLRP3、ASC和Caspase-1[19]。NLRP3激活后通過與NEK7相互作用,并與ASC和Caspase-1形成復合物(NLRP3炎癥體),然后將非活性炎性細胞因子如IL-1β轉化為成熟的炎性細胞因子,進而促進NF-κB的轉錄活性[20]。NF-κB途徑是腦梗死所致神經炎癥的關鍵轉錄途徑[21]。NF-κB主要以p65和p50組成的異源二聚體存在。在靜息細胞中,NF-κB存在于細胞質中,并與NF-κB抑制蛋白α(inhibitor a of NF-κB,IκBα)結合。在各種刺激下,IκBα被IκB激酶磷酸化并降解,這種降解導致p65/p50 NF-κB的核轉位,并促進許多促炎細胞因子基因的轉錄[22,23]。抑制NF-κB p65核轉位可以有效抑制缺血后小膠質細胞的激活和神經炎癥[7,24]。本研究結果表明,過表達LIF抑制了HIE新生大鼠腦缺血半影區中NLRP3炎癥體和NF-κB信號通路,從而抑制了神經炎癥。

總之,LIF可通過抑制NLRP3炎癥體和NF-κB信號通路的激活來有效抑制HIE后的小膠質細胞活化和神經炎癥。因此,LIF與NLRP3炎癥體和NF-κB信號通路的相互作用可能是預防和治療HIE的一種策略。