不同細胞標記物對大鼠牙髓干細胞體外標記的生物學影響

謝 娜,姬小婷,李子夏,唐成芳,陸 磊,王丹楊*

(1西安醫學院口腔醫學院口腔內科學教研室,西安 710021;2陜西中醫藥大學附屬醫院口腔科;3西安醫學院口腔醫學院口腔修復學教研室;*通訊作者,E-mail:kqwangdy@xiyi.edu.cn)

組織工程技術在臨床中的應用是近年來很多學者研究的熱點問題之一,由于干細胞具備多向分化的潛能,將干細胞移植在體內可用于機體各種組織修復以及組織再生,因而干細胞在臨床中具有巨大的應用潛力[1-3]。

目前,利用干細胞進行活體移植后,干細胞在移植體內的歸巢、分化機制是組織工程研究的重點問題,而對所移植的干細胞如何進行有效的標記以及示蹤則是開展該項研究的前提[4]。

研究表明,氯甲基苯甲酰氨(氯甲基-1,1-十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基-吲哚-羧花青-高氯酸鹽,chlormethylbenzamido-1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylin-docarbocyamine,CM-DiI)是一種親脂性長鏈碳花青熒光染料,易與細胞膜結合[5,6]。4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)能透過細胞膜快速進入活細胞中與DNA相結合。因此二者均可用于多種活細胞的標記[7,8]。

由于不同種屬、不同來源的細胞生物學性能有所不同,因此對標記物的敏感程度可能也存在著一定的差異。本實驗旨在對比CM-DiI和DAPI這兩種不同的細胞標記物對大鼠牙髓干細胞生物學性能的影響,為進一步的動物實驗提供理論支持,以及為需要進行細胞標記以及示蹤的實驗研究提供理論參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料

選取2個月齡健康的清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠20只,均為雄性,體質量為(250±20)g,由西安交通大學醫學院動物實驗中心提供。

DMEM/F12培養基、胎牛血清(Hyclone公司,美國);Ⅰ型膠原酶、Dispase酶(Gibco公司,美國);波形絲蛋白鼠來源單克隆抗體、角蛋白鼠來源單克隆抗體(上海生工生物工程技術服務有限公司,上海);地塞米松、吲哚美辛、丙酮酸鈉、IBMX、β-甘油磷酸鈉(Sigma公司,美國);CM-DiI、DAPI(Molecu-lar Probe公司,美國);乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所,南京);CCK-8細胞毒性檢測試劑盒(博士德公司,武漢);細胞培養箱(Thermo公司,美國);倒置相差顯微鏡(Nikon公司,日本)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠牙髓干細胞原代培養與純化 10%水合氯醛麻醉后脫頸處死大鼠,在超凈工作臺內劈開實驗所用的牙齒,輕柔地取出大鼠的牙髓組織,將其浸泡在按1 ∶1比例混合的Ⅰ型膠原酶和Dispase酶中,用外科手術剪將牙髓組織均勻剪成0.5-1 mm3大小的組織塊。隨后將其轉移至5% CO2、37 ℃的細胞培養箱中孵育45-60 min,孵育期間每15 min吹打一次消化液,直至組織塊完全消化、溶解。將培養皿中的消化液轉移至離心管中,1 000 r/min離心5 min后棄除上清液,加入PBS液重懸沉淀后,再1 000 r/min離心5 min,用此方法漂洗所得的沉淀物2次,用3-4 ml含15%胎牛血清的DMEM/F12培養基(培養基中加入100 U/ml青霉素,100 μg/ml鏈霉素和2 mmol/L的L-谷氨酰胺)重懸細胞沉淀,將全部液體轉移至60 mm的培養皿中培養,待有細胞貼壁生長后首次換液,其后每2-3 d更換培養液一次,采用有限稀釋法對所培養的細胞進行純化。

1.2.2 細胞來源鑒定 取生長狀態良好的第3代大鼠牙髓細胞,調整細胞密度為1×104個/ml,將其接種至預先裝有酸處理過的普通蓋玻片的12孔培養板中,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基培養,倒置顯微鏡下觀察細胞鋪滿蓋玻片的70%-80%時,按照免疫組化SAB法對其進行角蛋白、波形絲蛋白染色,光學顯微鏡下觀察、記錄染色結果。

1.2.3 細胞多向誘導分化實驗

1.2.3.1 成脂誘導分化 使用成脂誘導液(含濃度為0.5 mol/L的IBMX、0.25 μmol/L的地塞米松、10 μmol/L的吲哚美辛、L-谷氨酰胺2 mmol/L、L-抗壞血酸2-磷酸鹽100 μmol/L的DMEM/F12培養基),對第3代大鼠牙髓細胞培養4周后油紅-O染色,倒置顯微鏡下觀察、記錄脂滴的生成情況。

1.2.3.2 成骨細胞誘導分化 使用礦化誘導液(含濃度為10 nmol/L的地塞米松、50 μg/L的維生素C、β-甘油磷酸鈉10 mmol/L、L-谷氨酰胺2 mmol/L的DMEM/F12培養基)對第3代大鼠牙髓細胞培養4周后茜素紅染色,倒置顯微鏡下觀察、記錄礦化結節的生成情況。

1.2.3.3 成牙本質細胞誘導分化 取第3代大鼠牙髓細胞使用成骨誘導液連續培養21 d后,按照堿性磷酸酶(ALP)染色試劑盒說明書進行固定、染色,鏡下觀察。

1.2.4 CM-DiI工作液配制及細胞標記 取生長狀況良好的第3代大鼠牙髓干細胞消化離心,調整細胞濃度為1×105個/ml,取細胞懸液1 ml,移入離心管內。取50 μg裝的CM-DiI一支,溶于0.5 ml的DMSO中,混勻,配為100 μg/ml的母液。

細胞懸液中加入母液,使CM-DiI的終濃度為5 μg/ml。靜置于37 ℃條件下15 min,4 ℃條件下5 min,1 500 r/min離心5 min,棄上清,PBS重懸細胞,1 500 r/min再次離心5 min,以去除未與細胞結合的染料,加入2 ml基礎培養基重懸細胞。

1.2.5 DAPI工作液配制及細胞標記 采用CM-DiI工作液的具體配制過程,將配制好的工作液加入細胞濃度為1×105個/ml細胞懸液中,按照CM-DiI細胞標記液配置中的具體要求,配制終濃度為5 μg/ml的DAPI細胞標記液。

1.2.6 CM-DiI/DAPI標記后細胞增殖情況檢測 調整CM-DiI和DAPI標記后的細胞懸液濃度,以2×103個/孔的濃度各自接種于96孔板內,板內每孔含細胞懸液量為200 μl,將此孔的細胞作為實驗組。對照組為未使用標記物做過標記的細胞,常規培養。自接種后第1,2,4,7天采用CCK-8檢測試劑盒對所接種的細胞進行細胞增殖檢測,具體操作步驟為:PBS漂洗3遍,每孔加入20 μl的CCK-8液,37 ℃條件下孵育2 h,酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度值(optical density,OD值),記錄為A值,每組設有3個復孔,取平均值。

1.2.7 CM-DiI/DAPI標記后LDH釋放檢測 調整CM-DiI和DAPI標記后的細胞懸液濃度,以2×103個/孔的濃度各自接種于96孔板內,板內每孔含細胞懸液量為200 μl,將此孔的細胞作為實驗組。對照組為未使用標記物做過標記的細胞,常規培養。分別收集培養12,24,48,72 h的細胞培養液,1 500 r/min離心后取上清,按照LDH試劑盒說明書進行操作,酶聯檢測儀490 nm波長測定每孔吸光度值OD值。細胞LDH釋放率=(實驗組OD值-對照組OD值)/對照組OD值×100%;每組設有3個復孔,取平均值。

1.2.8 統計學分析 使用SPSS13.0軟件進行統計分析。數據以均值±標準誤表示。LDH釋放率以及細胞標記后增殖情況采用單因素方差分析進行統計檢驗;檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 大鼠牙髓細胞的培養及形態觀察

采用酶解組織塊法對大鼠牙髓細胞進行原代培養,培養24 h后就可見有少量細胞從組織塊中爬出(見圖1A),3-5 d后細胞就可伸展開來,大多數伸展開來的大鼠牙髓細胞呈長梭狀,類似于成纖維細胞的形狀;少數為多角形、橢圓形或者呈現出紡錘形(見圖1B)。

A.培養24 h大鼠牙髓細胞的形態 B.培養3-5 d后大鼠牙髓細胞的形態圖1 倒置相差顯微鏡下觀察大鼠牙髓細胞的形態 (bar=161 μm)Figure 1 Morphology of rat dental pulp cells observed under inverted phase contrast microscope (bar=161 μm)

2.2 大鼠牙髓干細胞的鑒定

2.2.1 細胞來源鑒定 培養的第3代大鼠牙髓細胞抗波形絲蛋白免疫組化染色后呈陽性表達(見圖2A);抗角蛋白染色后呈陰性表達(見圖2B)。證實所培養的大鼠牙髓細胞來源于間充質組織。

A.抗波形絲蛋白染色后呈陽性表達 B.抗角蛋白染色后呈陰性表達 圖2 大鼠牙髓細胞免疫組化染色結果 (bar=161 μm)Figure 2 Immunohistochemical staining of rat dental pulp cells (bar=161 μm)

2.2.2 細胞多向分化能力檢測 成脂誘導后經油紅-O染色發現實驗組有許多邊界清楚的小圓球狀橘紅色脂肪顆粒,部分細胞密集區顆粒可連接成串珠狀(見圖3A)。成骨誘導后經茜素紅染色發現實驗組細胞紅染,細胞間可見邊界不清的紅色礦化結節(見圖3B)。經礦化誘導液培養后進行ALP染色發現,誘導組細胞漿出現棕黃色條索狀或團塊狀陽性著色(見圖3C)。

A.油紅-O染色 B.茜素紅染色 C.ALP染色圖3 大鼠牙髓細胞多向分化能力檢測 (bar=161 μm)Figure 3 Multidirectional differentiation ability of rat dental pulp cells (bar=161m)

2.3 細胞標記后觀察

熒光顯微鏡下觀察可見CM-DiI染色后,大鼠牙髓干細胞的細胞漿呈現紅色熒光條帶,胞核未染,細胞呈現出良好的生長狀態(見圖4A);DAPI標記后,細胞核為藍色,細胞生長狀況良好(見圖4B)。

A.CM-DiI染色 B.DAPI染色圖4 熒光顯微鏡下觀察CM-DiI/DAPI標記的大鼠牙髓干細胞 (bar=161 μm)Figure 4 Observation of CM-DiI/DAPI-labeled rat dental pulp stem cells under fluorescence microscopy (bar=161 μm)

2.4 CM-DiI/DAPI標記后細胞增殖情況

兩種材料標記后的細胞與未標記細胞相比,在所選擇的4個時間點的OD值均無統計學差異(P>0.05,見表1),說明CM-DiI以及DAPI標記物對細胞增殖并未產生明顯影響。

表1 標記物標記后細胞增殖情況Table 1 Cell proliferation after marker labeling

2.5 CM-DiI/DAPI標記后細胞LDH釋放率比較

通過比較兩種細胞標記物標記后12,24,48,72 h培養液中的LDH含量發現,DAPI組的LDH釋放率在選取的4個測量時間點的OD值具有高于CM-DiI組的趨勢,但兩者差異無統計學意義(P>0.05,見圖5)。

圖5 CM-DiI/DAPI標記后LDH釋放率比較Figure 5 Comparison of LDH release rate after CM-DiI/DAPI labeling

3 討論

組織工程一直是近年來很多學者研究的熱點問題之一。自2000年Gronthos等[9]成功地將牙髓干細胞從成人恒牙中分離出來,關于牙髓干細胞如何更好地應用于臨床治療就是很多學者關注的問題。

很多學者長時間致力于研究干細胞的分化機制,發現干細胞可分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、血管內皮細胞等,因此干細胞如何更好地應用于臨床中的組織修復和組織再生是大家關注的問題[10-13]。

干細胞進行活體組織內移植,要觀察細胞移植后在植入體內是如何分化、遷移、存活以及體內分布,這些都離不開細胞標記以及示蹤技術,細胞標記效果的好壞直接影響到體內示蹤的效果。理想的細胞標記物應滿足以下條件:①操作簡便,不影響所標記細胞的生物學行為以及正常生理功能;②不影響宿主正常代謝功能;③標記產物穩定,可長時間存在于所標記的細胞內,易觀察到細胞在宿主體內的增殖、走行、組織分化以及體內分布等情況;④標記方法特異性強,靈敏度高,信號易于捕捉,易分辨產生新組織的來源[14-18]。目前常用的標記方法有:Y染色體標記、熒光染料標記、綠色熒光蛋白標記、分子細胞標記、影像學成像技術標記等。

對于不同種屬來源的細胞,標記物可能各有不同。但是目前哪種標記方法對間充質來源的牙髓干細胞標記效果更好,尚未有類似文獻報道,因此本實驗選取目前用于實驗中最具代表性的熒光染料標記物CM-DiI和DAPI對大鼠牙髓干細胞進行體外標記,旨在挑選出更適合大鼠牙髓干細胞的標記物,為隨后進一步的動物實驗以及需要進行大鼠牙髓干細胞標記以及示蹤的實驗提供理論指導。

本實驗通過酶解組織塊法獲得大鼠牙髓細胞,采用有限稀釋法對所培養的細胞進行純化,分離純化出具有克隆集落式生長的大鼠牙髓細胞。通過免疫組化證實所培養的細胞為間充質來源,并且培養的細胞具有向脂肪細胞、成骨細胞、成牙本質細胞分化的潛能,進一步證實所培養的細胞為大鼠牙髓干細胞。

CM-DiI作為一種親脂性、難溶于水的熒光染料,其易嵌入生物體的細胞膜內,并且嵌入后易在生物膜內做側向擴散運動,進而對整個細胞膜進行標記。根據文獻報道[19-22],該染料使用方便,在20 min左右即可使活細胞均勻著色,并且幾乎對所標記的活細胞無毒性作用,不影響細胞的存活、生長,是較為理想的細胞標記方法。DAPI是一種可使標記細胞的細胞核染色的熒光染料標記物,它能與細胞核內的DNA發生特異性結合,通過紫外光的激發可發出淺藍色熒光。DAPI可穿透活體細胞的細胞膜,對標記的細胞無明顯細胞毒性,是理想的細胞標記示蹤劑[23]。經CM-DiI/DAPI標記后的細胞,要檢測兩種不同類型的細胞標記物對標記后細胞的生物學影響,多通過標記物是否會對細胞代謝功能、酶活性、細胞膜完整性等這些方面進行綜合評價、對比。LDH是一種存在于活細胞胞漿內的糖酵解酶,當細胞膜受損后會產生釋放。因此可通過檢測細胞培養上清液中的LDH的活性或含量,作為檢測標記物是否會產生細胞毒性的敏感指標之一[24]。本實驗中選取兩種標記物在標記后12,24,48,72 h這4個不同的時間點,對兩種標記物標記后的細胞進行細胞毒性檢測,雖然組間差異并不具有統計學意義,但仍提示我們DAPI較CM-DiI而言,LDH的釋放率具有增加的趨勢。

本實驗證實,CM-DiI與DAPI這兩種標記物對大鼠牙髓干細胞進行體外標記時,具有操作方法簡便、染色速度快、標記率高的特點,這兩種標記物對所標記細胞毒性極小,但是相較DAPI而言,CM-DiI標記后LDH的釋放率更小。因此,CM-DiI能更為有效地對大鼠牙髓干細胞進行體外標記,是大鼠牙髓干細胞標記與示蹤的理想試劑。但是CM-DiI這種標記物對細胞活體內移植后組織分化、遷移的、存活的影響有待于進一步的動物實驗所證實。