磷酸二酯酶-5抑制劑通過抗氧化作用抑制大鼠肝細胞癌進展

周 楊,東 麗,劉佳佳,劉 偉*

(1內蒙古自治區人民醫院放療科,呼和浩特 010010;2內蒙古自治區人民醫院腫瘤內科;*通訊作者,E-mail:18047192753@163.com)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范圍內常見的腫瘤之一。目前用于治療HCC的抗癌藥物毒性大,生存率低,療效不理想。這主要是由于缺乏對HCC發生和發展的生化和分子機制了解。有研究觀察到,與正常或周圍非腫瘤組織相比,5型磷酸二酯酶(phosphodiesterase-5 inhibitors,PDE5)在癌癥中表達明顯增加[1]。由此表明PDE5可能對某些類型腫瘤具有抗癌活性,并可能增強癌細胞對標準化療藥物的敏感性。最近有文獻表明,在體外,2 μmol/L西地那非、索拉非尼和雷戈拉非尼增強了HepG2、HEP3B和HuH7細胞凋亡,而他達拉非(100 μmol/L)抑制了人肝癌細胞系HEP3B和PLC/PRF/F中髓源性抑制細胞,并增加了細胞因子誘導的殺傷細胞活性[2]。已有研究表明,西地那非通過增加細胞內活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),誘導細胞周期阻滯和凋亡,從而抑制人結腸癌細胞株的生長[3]。因而,本研究旨在評估PDE5抑制劑西地那非在二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DEN)誘導大鼠HCC中的抗癌作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

DEN和PDE5(美國Sigma公司);谷胱甘肽S-轉移酶活性(glutathione S-transferase,GST)和甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)(美國Sigma公司);HE染料(美國Sigma公司);氧化應激標記物檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)。

1.2 實驗動物分組及處理

雄性Wistar大鼠(150-180 g),購于內蒙古醫科大學實驗動物中心(動物許可證號:SCXK(蒙)2015-0001)。將Wistar大鼠隨機分成3組:對照組、DEN組和PDE5+DEN組,每組均10只。對照組大鼠在實驗期間(1-18周),每周腹腔注射0.2 ml生理鹽水;DEN組大鼠在18周內,每周腹腔注射0.2 ml DEN溶液(50 mg/kg)。PDE5+DEN組大鼠在18周內,每周腹腔注射0.2 ml DEN溶液(50 mg/kg),同時腹腔注射PDE溶液(10 mg/kg)。18周時,通過頸椎脫臼處死動物,分離肝臟,制備20%的組織勻漿,收集上清液并儲存在-20 ℃冰箱中,以評估氧化應激標記物。此外,將一部分肝組織保存在-80 ℃冰箱中,用于免疫印跡分析及HE染色。

1.3 免疫印跡分析GST和AFP

將保存在-80 ℃冰箱中肝組織取出,加入全細胞裂解液提取蛋白,用BCA法進行蛋白濃度測定。電泳樣品制備后,取30 g進行SDS-PAGE電泳,后轉至PVDF膜上。經5%牛奶孵育1 h后,并用磷酸鹽緩沖液洗膜。用兔抗GST和AFP多克隆抗體(1 ∶500)和鼠抗β-actin多克隆抗體(1 ∶1 000)孵育2 h。GST和AFP是可靠的HCC標志物。用山羊抗兔和山羊抗鼠二抗(1 ∶10 000)孵育1 h。洗膜后用化學發光掃描系統檢測并攝片,以β-actin為內參,應用圖像分析軟件Quantity one進行吸光度積分值分析。

1.4 組織病理學分析

取出肝臟,用PBS沖洗,用4%福爾馬林固定24 h,然后梯度酒精脫水。組織被轉移并嵌入蠟中,在切片機幫助下,從塊體上切下5 μm厚切片。將組織切片固定在涂有新鮮白蛋白干凈載玻片上,然后梯度酒精脫水。將切片通過二甲苯除去蠟,采用HE染色進行病理組織學分析。

1.5 氧化應激指標分析

采用相應的試劑盒檢測肝組織勻漿中丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)。

1.6 統計學處理

采用SPSS21.0統計軟件進行分析,數據以均數±標準差表示,組間比較采用單因素方差分析及Tukey’s檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PDE5對HCC標志物的影響

與對照組相比,DEN組GST和AFP表達顯著增加(P<0.05);PDE5+DEN組PDE5治療HCC大鼠后,GST和AFP表達顯著降低(P<0.05見圖1,表1)。

圖1 Western blot檢測PDE5對HCC標志物的影響Figure 1 Effect of PDE5 on HCC markers by Western blot

表1 不同組大鼠肝臟GST和AFP相對表達比較(n=10)Table 1 Relative expression of GST and AFP in liver of rats in different groups (n=10)

2.2 PDE5對組織病理學的影響

在HE染色切片的組織學檢查中,對照組肝細胞形態正常;DEN組大鼠中,肝臟表現為大量細胞增生、多形性、異型性,以及核質比和有絲分裂增加;PDE5+DEN組大鼠肝臟細胞增生、多形性和異型性明顯改善,同時核質比和有絲分裂降低(見圖2)。

圖2 不同組大鼠肝臟HE染色 (×100)Figure 2 HE staining of liver in different groups (×100)

2.3 PDE5對氧化應激標志物的影響

與對照組相比,DEN組大鼠肝臟中SOD、CAT和GPx活性明顯下降(均P<0.05);MDA水平升高(P<0.05)。與DEN組相比,PDE5+DEN組PDE5抑制劑治療后SOD、CAT和GPx活性升高(均P<0.05);MDA水平降低(P<0.05,見表2)。

表2 PDE5對氧化應激標志物活性影響 (n=10)Table 2 Effects of PDE5 on the activities of oxidative stress markers (n=10)

3 討論

在肝癌的發生發展過程中,腫瘤部位存在著生化變化,可以作為研究腫瘤發生發展的標志物。在這方面,GST已被用作HCC標記物。GST對肝臟中DEN代謝后產生的毒性物質具有重要的解毒作用。在本研究中,我們觀察到在DEN誘導HCC大鼠中GST蛋白表達增加。GST表達水平增加證實了基因毒性誘導的大鼠肝癌的發生。有研究通過監測HCC治療大鼠肝臟中GST表達的下降,成功地證實了化合物的抗癌特性,例如白藜蘆醇[4]。使用類似的方法,我們發現用PDE5抑制劑西地那非治療HCC大鼠導致GST表達顯著下降。其他研究組也報道了PDE5抑制劑西地那非在不同癌癥中的抗癌活性,例如,在體外,西地那非可直接觸發B-慢性淋巴細胞白血病細胞中的半胱氨酸蛋白酶依賴性凋亡[5]。肝腫瘤組織分泌多種腫瘤相關蛋白作為診斷、預后的標志物,其中AFP目前用于DEN誘導的HCC診斷。AFP是HCC診斷的主要標志物,約半數HCC腫瘤分泌AFP[6]。因此,在本研究中,AFP表達增加進一步證實了DEN誘導HCC的發生。然而,用PDE5治療肝癌大鼠后,導致AFP顯著下降。上述結果通過觀察正常大鼠、HCC大鼠和PDE5治療的HCC大鼠的肝細胞組織學變化得到證實。本研究肝組織病理學顯示,在DEN誘導的HCC大鼠中,表現為大量細胞增生、多形性、異型性,以及核質比和有絲分裂增加。與我們的研究一致,其他研究也報道了DEN誘導肝組織毒性是導致癌前病灶的原因,DEN誘導的肝細胞癌中,肝細胞損傷表現為核染色質濃縮,邊緣與核膜相連,形成半月形或圓形致密的核殘余,肝細胞收縮,胞漿濃縮[7]。用PDE5治療HCC大鼠后,HCC大鼠肝臟組織學顯著恢復。

氧化應激通常與過多的ROS產生有關,表現為生物體正常氧化還原狀態的破壞。關于腫瘤的發展,氧化應激是一把雙刃劍,一定程度的氧化應可刺激腫瘤生長,然而持續增強的氧化應激在體內外誘導腫瘤細胞凋亡[8]。在本研究中,在DEN誘導的HCC中觀察到所有抗氧化酶(SOD、CAT和GPx)水平降低,我們的發現與其他文獻研究一致[9],DEN誘導的肝癌發生也與抗氧化酶水平降低而產生的氧化應激有關。氧化應激最重要的后果是脂質過氧化和細胞膜通透性改變。我們也可以觀察到DEN誘導的HCC大鼠MDA水平顯著增加,這與其他早期報道一致[10]。在本研究中,MDA評估可作為DEN誘導的肝癌脂質氧化應激的標志物。脂質過氧化水平升高是由于活性氧的過量產生和SOD、過氧化氫酶和GPx等抗氧化劑減少,最終導致膜脂的損傷。在用PDE5治療HCC大鼠后,抗氧化酶如SOD、CAT和GPx顯著增加,同時DEN誘導HCC大鼠的MDA水平下降。與我們的工作類似,在另一項研究中,PDE5抑制劑他達拉非在大鼠脊髓損傷后增加抗氧化酶(SOD、CAT和GPx)活性,并降低MDA水平[11]。以往也有報道,PDE抑制劑西地那非治療可降低健康男性血液中MDA水平[12]。此外,西地那非可提高大鼠睪丸扭轉扭轉損傷時SOD、GPx和CAT活性,降低MDA水平[12]。MDA減少可能是由于PDE5治療大鼠后,誘導了超氧化物歧化酶和CAT,因為這些酶在清除自由基方面起著重要作用。

本研究結果顯示,在DEN誘導的HCC發生發展過程中,腫瘤標志物GST和AFP表達顯著增加。深入研究其機制發現,在DEN誘導的肝癌發生發展過程中,SOD、CAT和GPx等抗氧化酶活性降低,MDA水平升高。用PDE5抑制劑西地那非治療后,上述指標均顯著改善。上述研究結果提示PDE5抑制劑可能通過調節抗氧化途徑關鍵參數來阻止HCC進展,從而發揮抗癌作用。