杉木內生細菌SM-1的鑒定及其對杉木赤枯病的防治效果

劉雨菁，曾華龍，梁煒康，盧 夢，朱偉垚，張 蕾，宋 漳，張清華 *

（1. 福建農林大學林學院森林保護研究所，福建 福州 350002；2. 華南農業大學教育部天然農藥與化學生物學重點實驗室，廣東 廣州 510642；3. 四川省農業科學院植物保護研究所，四川 成都 610066）

0 引言

【研究意義】杉木（Cunninghamia lanceolata）是我國特有的用材樹種，因其具有生長快，產量高，材質好，用途廣的特點而被大量種植，是我國南方最重要的商品用材樹種之一，在我國林業生產中占十分重要的地位[1]。杉木生長過程中受到多種真菌病害的為害，杉木赤枯?。–opper blight）是為害杉木苗期和幼林的重要病害，病原菌從針葉侵入，針葉漸變為紅褐色，后擴展到頂梢，頂部枯死或整株枯死，嚴重威脅杉木種苗生產和幼林的成長，安全有效地防治該病是目前杉木種植業亟待解決的問題[2]。【前人研究進展】現有杉木赤枯病的防治主要依賴化學農藥[2]，農藥濫用引發的病原菌抗藥性、環境污染等問題越發引起人們對生態安全的擔心[3]。生物防治被認為是極具潛力的環境友好型植物病害防治措施，相對于化學農藥，具有無污染、無殘留、不殺傷天敵、不易產生抗藥性、利于人畜安全、兼防兼治、增產增收等優點[4?5]?！颈狙芯壳腥朦c】眾多生物防治因子容易受環境因素影響，防病效果不穩定，植物內生菌因其受寄主內環境的保護及其可以直接面對侵入植物的病原菌等優點，近年來越來越受到人們的關注，已經成為生物防治因子的重要來源[6]。內生真菌普遍存在于目前所有已知的植物中[7?9]，杉木內生菌亦被證實存在種類豐富性，并且在促進杉木生長及其在低磷脅迫下生長、抵抗病原菌等方面具有潛在的應用價值[10?11]。【擬解決的關鍵問題】本研究的供試菌株為福建農林大學森林保護研究所保存的杉木內生細菌SM-1，前期試驗發現該菌株能夠顯著抑制杉木赤枯病菌（Pesalotiopsis apiculatus）的生長。本研究旨在通過形態學結合16S rDNA序列分析和Biolog系統鑒定SM-1的種類；采用含毒平板和牛津杯法探究SM-1無菌發酵液對杉木赤枯病菌的拮抗性；并對SM-1無菌發酵液在離體枝條的杉木葉片上的防效進行評估，研究結果將為杉木赤枯病的生物防治提供資源，為從杉木內生菌中篩選赤枯病生物防治因子奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

杉木赤枯病病原菌Pesalotiopsis apiculatus及供試生防菌SM-1由福建農林大學森林保護研究所分離并保存在?80 ℃的甘油（25%,V/V）中。杉木赤枯病病原菌在PDA培養基上25 ℃活化培養3 d，SM-1是杉木葉片內生細菌，在LA培養基上28 ℃活化培養3 d。

1.2 培養基

LB培養基：胰蛋白胨10 g·L?1；酵母提取物5 g·L?1；NaCl 10 g·L?1；pH 7.0～7.2。

PDA培養基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL。

以上培養基經121 ℃滅菌30 min備用。

1.3 細菌SM-1的鑒定

1.3.1 形態學鑒定 將SM-1在LA培養基上三區劃線法劃線[12]，培養3 d后，觀察菌落的形態，挑取培養的SM-1單菌落于100 mL LB培養基中，150 r·min?1，28 ℃搖培1 d，獲得菌懸液，參照文獻[13]的方法進行革蘭氏染色，以已知的革蘭氏陰性菌假單胞菌（Pseudomonas）作為參考菌株，然后顯微鏡下觀察其 顏色和細胞形態。

1.3.2 生理生化鑒定 對該菌株進行氧化酶活性及碳 源利用等幾方面的測定, 按文獻[13]的方法進行。

1.3.3 16S rDNA序列分析 采用試劑盒提取菌株SM-1的總DNA。采用細菌通用引物27F和1492R擴增16S rDNA基因序列[14]。凝膠電泳檢測PCR產物并回收，回收的PCR產物連接pMD18-T載體后轉化大腸桿菌E. coliDH5α，挑選陽性克隆送至上海生工公司進行雙向測序，獲得的序列用DNAMAN軟件進行拼接后去除殘留的載體序列并提交至Ezbiocloud（https://www.ezbiocloud.net/）數據庫進行比對，下載最為相似的且是模式菌株的序列，使用MEGA7.0利用Neighbor-joining方法構建菌株SM-1的系統發育進 化樹。

1.3.4 Biolog鑒定 菌株SM-1在28 ℃的BUG培養基上生長48 h，挑取少量菌落制備菌懸液。與標準菌懸液進行濁度對比，菌懸液含量調節至90%～98%T后加入GEN III微孔板，每孔加樣100 μL。準備好的GEN III微孔板放入培養箱28 ℃培養。在培養24 h時 讀取數據，并通過與數據庫比較獲得鑒定結果。

1.4 SM-1對杉木赤枯病菌的抑制

采用平板對峙方法檢測SM-1對赤枯病菌的拮抗作用[15]。在培養基一側劃線3 cm長的細菌生長區，在間隔SM-1培養0、24、48、72 h后接種杉木赤枯病菌，赤枯病菌菌餅5 mm，距離細菌生長區5 cm，25 ℃共培養5 d后，測量病原真菌生長直徑 ，計算抑菌率。每個處理設置3個重復，試驗重復2次。

挑取生長3 d的SM-1單菌落至離心管中，加入適量無菌水制備菌懸液，調節菌懸液OD600=0.6。分別吸取200 μL菌懸液接種至7個100 mL PDB培養基中，置于28 ℃的恒溫搖床中150 r·min?1培養。分別在培養1、2、3、4、5、6、7 d時取出。將發酵液12 000 r·min?1，離心10 min棄掉菌體獲得上清液，上清液通過0.22 μm的無菌濾膜抽濾，收集濾液，獲得SM-1無菌發酵液，4 ℃保存備用。

采用牛津杯法進行發酵液抗菌能力的測定[16]。向牛津杯中加入200 μLSM-1無菌發酵液，在距離牛津杯5 cm的位置接種直徑5 mm的赤枯病菌菌餅，25 ℃恒溫培養，測量菌絲的生長直徑和抑菌圈直徑，對照組牛津杯加入200 μL無菌水代替SM-1無菌發酵液。每個處理組重復3次，試驗重復2次。

使用發酵3 d的無菌發酵液與PDA培養基做成含毒平板，檢測不同含量發酵液對杉木赤枯病菌的抑制作用。制成含無菌發酵液1%、5%、10%、15%、20%（V/V）的毒性平板，以加10%無菌水的PDA平板作為對照。在平板中央接種直徑5 mm的杉木赤枯病菌菌餅，25 ℃培養箱培養。培養7 d后，用十字交叉法測量對照組和處理組致病菌生長直徑（mm），計 算抑菌率。每個處理組重復3次，試驗重復2次。

1.5 SM-1無菌發酵液防治杉木赤枯病

采用新鮮的杉木枝條，用培養3 d的無菌發酵液涂抹在健康的杉木葉片上，自然風干后每個葉片接種一個直徑5 mm的赤枯病菌菌餅，共接種20個葉片，放置在25 ℃的光照培養箱中保濕培養，每天觀察，記錄發病葉片的個數，測量病斑的長度。試驗重 復2次。

1.6 數據統計分析

對試驗中獲得的數據使用SPSS軟件進行方差分析。SM-1發酵液對杉木赤枯病菌抑菌率，不同含量發酵液對核赤枯病菌的抑菌率，不同處理油菜葉片發病率和病斑直徑，均采用鄧肯多重比較法（Duncan’s Multiple Range Test），在a=0.01水平檢測不同處理的 差異性。

2 結果與分析

2.1 細菌SM-1的種類

SM-1在LA培養基上菌落呈現灰白色，中間凹陷，邊緣不完整，菌落表面有褶皺（圖1）。經革蘭氏染色，菌株SM-1細胞呈紫色，為革蘭氏陽性菌（G+），菌體細胞呈桿狀，細胞大小約2 μm（圖1）。

圖1 菌株SM-1革蘭氏染色及形態顯微觀察（標尺10 μm）Fig. 1 Gram-stained cell and morphology of SM-1 under microscope (bar = 10 μm)

對菌株SM-1利用氧化酶活性、乳糖等其他生理生化特性進行測試，結果均為陰性（表1）。這些特性也與萎縮芽孢桿菌（B. atrophaeus）的特征相一致。

表1 生理生化鑒定結果Table 1 Physiological and biochemical characteristics of SM-1

純化的PCR產物經測序、拼接、去除載體序列后得到長度為1 455 bp的序列，序列提交到NCBI數據庫，獲得登記編號MN592638。通過Ezbiocloud比對，與菌株SM-1相似性高于97%的細菌種類有17種，均屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），其中與貝萊斯芽孢桿 菌（B. velezensis）和B. subtilissubsp.stercoris相似性高達99%以上，與暹羅芽胞桿菌（B. siamensis）、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）、萎縮芽孢桿菌（B. atrophaeus）等11個種類相似性超過98%（表2）。根據16S rDNA構建的SM-1進化樹發現，SM-1與貝萊斯芽孢桿菌、暹羅芽胞桿菌、解淀粉芽孢桿菌和萎縮芽孢桿菌進化關系較近（圖2）。

圖2 菌株SM-1系統發育進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of SM-1

表2 與菌株SM-1最為相似的細菌種類Table 2 Bacterial species with closest similarity to SM-1

Biolog鑒定系統輸出的鑒定結果顯示，SM-1與萎縮芽孢桿菌（B. atrophaeus）相似性值為0.631＞0.50，雖位距值稍大于5，但比另外3個種類，解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）、摩加夫芽孢桿菌（B. mojavensis）、簡單芽胞桿菌（B. simplex）的位距?。ū?），Biolog鑒定結果為萎縮芽孢桿菌（B.atrophaeus）。綜合形態鑒定、16S rDNA分析和Biolog鑒定結果，鑒定SM-1為萎縮芽孢桿菌（B. atrophaeus）。

表3 Biolog系統對細菌菌株SM-1的鑒定Table 3 Identification of bacterial strain SM-1 by Biolog system

2.2 細菌SM-1對杉木赤枯病菌的抑制

對峙試驗結果顯示，在間隔菌株SM-1培養時間越長，SM-1對赤枯病菌的抑菌率越高，培養72 h的SM-1對赤枯病菌的抑制效果最強，抑制帶寬度25.05 mm，抑菌率為46.83%，顯著高于其他測試的抑菌率（圖3）。說明SM-1向培養基中分泌抗菌物質。菌株SM-1的無菌發酵液對杉木赤枯病菌有顯著的抑制作用，培養前3 d，隨著發酵時間延長，抑菌效果增強；3 d后，隨著時間延長，抑菌效果再無提升（圖4）。

圖3 菌株SM-1對杉木赤枯病菌的抑制率Fig. 3 Inhibitory rate of SM-1 against P. apiculatus

圖4 不同發酵時間發酵液對杉木赤枯病菌的抑制效果Fig. 4 Inhibitory effect on P. apiculatus by fermentation broth cultured for different length of time (Oxford cup method)

含毒平板抑菌試驗表明PDA平板中含有1%菌株SM-1的發酵液，對杉木赤枯病菌生長幾乎沒有抑制作用，抑制率僅有0.7%，無明顯抑制作用（P=0.75＞0.05）；當發酵液含量達到5%時，發酵液抑菌率達到21.90%，杉木赤枯病菌的生長受到極顯著抑制（P＜0.01），而且隨著發酵液含量增加，抑菌效果更加顯著，當含毒平板SM-1發酵液含量為20%時，抑菌率為58.80%（圖5）。

圖5 不同含量發酵液的PDA平板對致杉木赤枯病菌的抑制效果Fig. 5 Inhibition effect on P. apiculatus by varied concentrations of fermentation broth in PDA plate test

2.3 SM-1對赤枯病菌菌絲的影響

顯微鏡觀察發現，對照組赤枯病的菌絲生長形態正常，原生質菌液，菌絲分枝正常。而經SM-1處理的赤枯病菌菌絲分枝明顯減少而且分枝的菌絲生長 受到抑制，菌絲細胞大量膨大，呈圓球狀（圖6）。

圖6 菌株SM-1對杉木赤枯病菌菌絲影響Fig. 6 Effect of SM-1 on P. apiculatus mycelial growthobserved under optical microscope

2.4 發酵液生物防治效果評估

接種后3 d，對照組的20個杉木葉片全發病，發病率為100%，平均病斑長度21.53 mm，而用SM-1發酵液處理的杉木葉片，只有1個葉片發病，發病率為5%，防治效率為95%；對照組病斑長度平均為21.53 mm，處理組病斑長度平均為0.25 mm，SM-1無菌發酵液處理的杉木葉片赤枯病發病率和嚴重程度極顯著低于對照組（P＜0.01）（圖7）。這表明菌株SM-1的發酵液對杉木赤枯病具有良好的防治效 果。

圖7 菌株SM-1無菌發酵液對杉木赤枯病的防治效果Fig. 7 Biocontrol efficacy of SM-1 fermentation broth on copper blight of Chinese fir

3 討論

杉木是我國重要經濟林，其在生長過程中受多種病蟲害的影響，由頂枯擬多毛孢（P. apiculatus）引起的杉木赤枯病是杉木的主要葉部病害之一，多發生于苗期和幼樹期，目前主要靠化學農藥手段來防治杉木赤枯病[2]。而且現在受環境友好型與可持續發展理念的影響，生物防治越來越受到人們的關注，而植物內生菌與宿主之間互生惠利的奇特關系，使內生菌成為篩選生防因子的天然候選者[17]，因此，挖掘一株能夠有效防治杉木赤枯病的生物藥劑，具有巨大的生態效益和經濟效益。本研究發現杉木內生細菌菌株SM-1對杉木焦枯病菌表現出的抑菌率雖然僅有58.8%，但是其離體枝條防病效果達到95%，是杉木赤枯病生物防治的優良菌種資源。雖然SM-1對杉木赤枯病的離體防病試驗效果良好，但是自然環境下的防病試驗還需進一步研究，以檢測受不同環境因素影響下SM-1發酵產物的防病能力。

經過多相鑒定，確定菌株SM-1是萎縮假單胞菌（B. atrophaeus）。芽孢桿菌屬細菌廣泛分布于土壤、植物體內、空氣等多種自然環境中，加之芽孢桿菌產生多種活性代謝產物，具有耐熱性，對環境營養要求簡單，繁殖定殖能力強，對環境的抗逆性強，易生產與加工等特點，使得芽孢桿菌制劑在植物病害防治中得到了廣泛應用[18]?，F已發現有23個種的芽孢桿菌具有生物防治的功能，其作用機制主要包括誘導競爭作用、分泌抗菌物質和誘導抗性等幾個方面[19?20]。萎縮芽孢桿菌（B. atrophaeus）是重要的植物病害生防菌，從土壤中分離到的萎縮芽孢桿菌已經證實對棉花黃萎病、枸杞葉枯病等植物病害有防治潛力[21,22]。萎縮芽孢桿菌能夠產生蛋白質類、肽類等不同類型的抗菌物質。平板抑菌試驗證實SM-1產生抗菌類代謝物質，其代謝物質的種類目前還在鑒定當中。平板抑菌試驗顯示20%（V/V）的SM-1無菌發酵液抑菌率僅為58.8%，但其防病效果能達到95%，推斷SM-1次級代謝物質不僅能夠影響病原菌的致病能力，或許還能夠誘導杉木對病原菌的抵抗力，對SM-1無菌濾液處理后杉木葉片的生理生化及基因轉錄水平的差異研究可為SM-1防病作用機制奠定理論基礎。

本研究供試菌株SM-1，是從杉木葉片內生細菌中篩選出的，其無菌發酵液對杉木赤枯病良好的防治效果說明該菌是具潛力的杉木赤枯病生物防治資源。抑菌成分的鑒定及抑菌機理的研究將為該菌的開發和利用奠定基礎。

4 結論

經形態觀察、16S rRNA測序及Biolog系統檢測，鑒定SM-1為萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）；含毒平板及牛津杯法檢測到SM-1無菌發酵液對赤枯病菌的抑制率可達58.80%，顯微觀察顯示SM-1能夠使赤枯病菌菌絲生長受到抑制，細胞膨大成球形；離體枝條的葉片接種試驗揭示SM-1的無菌發酵液對杉木赤枯病的發病率的抑制效率達95%，并且極顯著減輕葉片發病程度（P＜0.01）。