辣木查爾酮合成酶（CHS）基因的克隆及其序列分析

林 玲，方健超，陳觀水，艾育芳 *

（1. 福建衛生職業技術學院，福建 福州 350101；2. 福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】辣木（Moringa oleiferaLam.）也稱鼓槌樹，屬于十字花目辣木科辣木屬，為多年生熱帶落葉喬木，廣泛種植于亞洲、非洲和中美洲的熱帶、亞熱帶地區，在我國云南、廣西、廣東、臺灣、福建等地均有種植[1?4]。辣木富含黃酮類化合物（flavonoids）、植物蛋白、維生素A、維生素C、葉酸、泛酸、鈣、鐵、鋅、硒、鉀等多種營養素，具有“超級營養庫”之稱[2]。研究表明，類黃酮化合物是辣木葉中的主要組分之一，平均含量在3%～6%[1,4]。藥理學研究表明，辣葉黃酮類提取物在II型糖尿病的預防和治療中可降低葡萄糖耐受、血糖及血脂含量[1]；王玲玲等[3]研究表明辣木葉總黃酮提取物能提高運動耐力，延緩疲勞發生。2012年我國衛生部批準將辣木葉作為新資源食品，可用于功能食品開發[3]。因此，開展辣木植物中黃酮類化合物的生物合成途徑中的關鍵酶基因的克隆、功能鑒定及其調控機制的研究，有助于提高辣木的品質及其資源的開發利用。【前人研究進展】目前，有關黃酮類化合物的生物合成途徑的步驟已基本清楚[5,6]。查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS，EC2.3.1.74）為III 型聚酮體合成酶（polyketide synthase，PKS）家族的一員，是啟動黃酮類化合物次生代謝生物合成的第1個關鍵限速酶，負責催化3分子丙二酰-CoA和1分子對香豆酰-CoA縮合形成查爾酮[7?13]，隨后進一步產生各類的黃酮類化合物（如蘆丁，花青素等）。CHS廣泛存在于植物中，目前，已從煙草[8]、大豆[9]、藤茶[5]等眾多植物中克隆和鑒定了CHS基因。【本研究切入點】目前，雖然對辣木基因組序列進行了測序，但對于辣木查爾酮合成酶的克隆及注釋有待進一步深入研究。【擬解決的關鍵問題】本研究擬基于NCBI數據庫中辣木基因組信息結合其他植物的查爾酮合成酶基因核苷酸序列設計PCR引物，通過PCR技術分別分離1條辣木CHS基因（命名為MoCHS1）的完整開放讀碼框序列（open reading frame, ORF）和基因組DNA（genomic DNA），并對其進行生物信息學分析，為進一步解析辣木類黃酮物質的生物合成與調控機制及CHS基因家族進化提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

辣木葉片采取福建農林大學田間植物園。

1.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

采用Omega公司Plant RNA Kit提取辣木葉片總RNA，操作步驟按照說明書進行，經瓊脂糖電泳及核酸蛋白檢測儀檢測符合反轉錄要求的RNA 樣品溶液，置于?80 ℃冰箱保存備用。利用湖南艾科瑞生物工程有限公司Evo M-MLV RT試劑盒進行辣木cDNA第 一鏈的合成。

1.3 引物設計與合成

根據NCBI數據庫中辣木基因組信息結合其他植物CHS基因信息，利用 DNAMAN 9.0 軟件在起始密碼子及終止密碼附近設計引物一對，引物由福州尚亞生物技術有限公司合成，引物序列：MoCHSF:5′-GTCATCAATGGCGGCATCAGTG-3′；MoCHSR:5′-A CCACTCACTCCCTACCCTTGAT-3′。

1.4 辣木CHS1基因的克隆

利用1.3設計的PCR引物進行辣木CHS基因的克隆。PCR反應體系如下：MoCHSF和MoCHSR（約100 ng·μL?1）各1 μL，10×Buffer 2 μL，TaqDNA polymerase（5 U·μL?1）0.2 μL，dNTPs（10 mmol·L?1）0.5 μL，正反向引物各1 μL，ddH2O 14.3 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min 后，分別于94 ℃變性30 s、62 ℃退火30 s和72 ℃延伸90 s，共進行30 個循環，最后在72 ℃延伸10 min。PCR產物保存于4 ℃備用。PCR 產物在經1%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像儀拍照，并切下目的條帶。利用OMEGA公司的Gel Extraction Kit回收純化目的DNA 片段，純化后的DNA 連接到pESAY-T1 克隆載體（TransGen Biotech），轉化大腸桿菌感受態DH5α菌株，篩選并經PCR鑒定 的陽性菌落送福州尚亞生物技術有限公司測序。

1.5 辣木CHS1生物信息學分析

利用Blast軟件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）進行在線核苷酸和氨基酸序列分析；利用Protparam（http://web.expasy.org/protparam/）進行在線氨基酸序列相對分子質量、等電點、不穩定系數等理化性質進行分析；利用PSORTPrediction（https://wolfpsort.hgc.jp/）進行蛋白亞細胞定位分析；利用SignalP-5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行氨基酸信號肽預測；采用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl/page=npsa_sopma.html）預測蛋白二級結構；利用DNAMAN 9.0進行查爾酮合成酶基因編碼氨基酸序列多重比對分析；采用MEGA 10.0軟件構建CHS蛋白的系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 MoCHS1基因的克隆與結構分析

分別以辣木的cDNA和基因組DNA為模板，利用特異引物CHSF 和CHSR 擴增，分別獲得約1 200 bp和1 500 bp的特異條帶（圖1-A），經過膠回收、克隆測序及Blast比對分析發現，該DNA片段與GenBank核酸數據庫中登錄的番木瓜（Carica papaya）、石榴（Punica granatum）、蕓香（Ruta graveolens）、山葡萄（Vitis amurensis）等植物的查爾酮合成酶的編碼序列相似性較高，推導的氨基酸序列也與數據庫中已知的CHS蛋白氨基酸序列的相似性也較高，由此可以初步推測分離所得DNA序列為辣木查爾酮合成酶的基因序列，并命名該基因為MoCHS1。序列分析表明，以cDNA為模板擴增得到的MoCHS1ORF序列長度為1 185 bp，編碼394個氨基酸（圖2），以辣木基因組DNA為模板擴增得到的gDNA序列長度為1 387 bp，兩者對比發現，MoCHS1基因中間具有一個內含子（202 bp）序列，外顯子1為183 bp，外顯子2 為1 002 bp（圖1-B）。

圖1 辣木MoCHS1基因的克隆與結構分析Fig. 1 Cloning and structure of MoCHS1 of M. oleifera

圖2 辣木MoCHS1 cDNA 核苷酸序列及推導的氨基酸序列Fig. 2 Nucleic acid and putative amino acid sequence of MoCHS1 of M. oleifera

2.2 MoCHS1蛋白質理化性質分析

采用ProParam在線分析工具，對MoCHS1氨基酸序列的理化性質進行預測，結果顯示MoCHS1的相對分子量為43.07 KD，等電點（pI）為5.84，分子式為：C1914H3 071N515O573S19，不穩定指數為36.04＜40，脂肪族指數為93.83，總親水性平均值（GRAVY）為?0.067＜0，推測該蛋白為穩定親水蛋白。在MoCHS1編碼的氨基酸中，含量最高的是亮氨酸和丙氨酸，分別占10.4%和9.1%，半胱氨酸和色氨酸所占比例最小，分別占1.8%和1.0%；其中帶負電荷氨基酸殘基（Asp + Glu）總數50個，占氨基酸總數的12.7%，而帶正電荷氨基酸殘基總數為44個，占氨基酸總數為 11.2%，推測該蛋白帶負電荷。

2.3 MoCHS蛋白質結構分析

采用SignalP 5.0在線分析表明，辣木MoCHS1蛋白沒信號肽；Wolf-psort分析MoCHS蛋白的亞細胞定位顯示，在細胞質、葉綠體及液泡中均有分布，而以在細胞質中分布為主。使用SOPMA工具進行分析二級結構分析表明MoCHS1蛋白以α-螺旋（45.43%）和不規則卷曲（31.98%）為主，其次有延伸鏈（16.75%）、β-轉角（5.84%）（圖3）。采用Swissmodel對MoCHS1蛋白的三級結構進行預測（圖4），結果與其二級結構預測相一致。

圖3 MoCHS1的二級結構預測分析Fig. 3 Prediction and analysis on secondary structure of MoCHS1

圖4 MoCHS1蛋白質三級結構預測Fig. 4 Prediction of tertiary structure of MoCHS1

2.4 MoCHS的系統進化分析

利用DNAMAN9.0對推測的辣木MoCHS1的氨基酸序列與大豆（GmCHS,）、番木瓜（CpCHS）、擬南芥、煙草、葡萄、黃芩等植物CHS基因氨基酸序列進行多序列比對。結果（圖4）表明辣木MoCHS1與大豆、番木瓜、擬南芥、煙草、葡萄、黃芩的相似度分別為85%、88%、84.9%、85.9%、87.5%、81.3%。MoCHS1和其他植物中的CHS蛋白一樣，含有查爾酮合成酶基因家族高度保守的氨基酸殘基，包括7個環化袋氨基酸殘基、3個輔酶A活性結合位點、半胱氨酸（Cys）-組氨酸（His）-天冬氨酸（Asn）三聯體催化活性位點和CHS基因家族的2個高度保守氨基酸特征序列（RLMMYQQGCFAGGTVLR和GV LFGFGPGL）（圖5）。這些結果進一步說明本研究所克隆的基因序列為辣木查爾酮合成酶基因序列。

圖5 辣木MoCHS1氨基酸序列與其他物種CHS氨基酸序列的多序列比對分析Fig. 5 Multiple alignment on amino acid sequences of CHS of M. oleifera and other species

運用MEGA10.0軟件構建辣木MoCHS1與大豆、擬南芥、煙草等29種植物CHS編碼氨基酸序列的系統進化樹。結果表明，MoCHS1與來源于番木瓜的CHS基因聚在一類，說明其親緣關系最近，與來源于破布葉、麻風樹等植物CHS基因的進化關系也較近，而與來源于玉米、水稻、小麥等單子葉植物的CHS基因進化關系較遠（圖6）。

圖6 辣木MoCHS1與其他物種CHS的系統進化樹分析Fig. 6 Phylogenic tree of putative amino acid sequences of MoCHS1 of M. oleifera and CHS of other species

3 討論與結論

查爾酮合成酶（CHS）屬于高等植物中高度保守的III 型聚酮體合成酶（polyketide synthase, PKS），是植物黃酮類化合物合成途徑的第1個關鍵酶，參與重要中間產物查爾酮的形成[5，13，14]。前人研究表明，大部分植物的CHS基因家族均含有1個內含子[8?10]。本研究根據NCBI中辣木基因組測序結果設計引物，首次分別從cDNA和基因組DNA中分離獲得MoCHS1。序列分析表明，以cDNA為模板擴增得到的MoCHS1 ORF序列長度為1 185 bp，編碼394個氨基酸，以基因組DNA為模板擴增得到的gDNA序列長度為1 387 bp，兩者對比發現，MoCHS1具有1個內含子，結構特征與基因大小與多數物種CHS的大小基本一致。MoCHS1蛋白亞細胞定位結果顯示該蛋白主要分布在細胞質中。蛋白質的二級結構主要有α-螺旋、β-轉角、β-折疊及不規則卷曲，其中α-螺旋是蛋白質中最常見的二級結構元件，不規則卷曲也是明確而穩定的結構[15]。不同植物中的CHS基因在數量、結構和功能上均存在差異[15]，MoCHS1蛋白的二級結構主要以α-螺旋（45.43%）和不規則卷曲（31.98%）為主，β-轉角（5.84%）最少。MoCHS1蛋白的三級結構以α-螺旋和不規則卷曲為主，與二級結構預測結果基本一致。推導的氨基酸序列分析表明，MoCHS1含有所有查爾酮合成酶基因家族中高度保守的特征氨基酸序列“GVLFGFGPGL”及活性氨基酸殘基位點，如輔酶A活性結合位點、Cys-His-Asn三聯體催化位點和環化袋等[16?18]。這些結構特征表明本研究克隆的基因序列具備CHSs家族的共有特性，為辣木CHS的序列[5,11,13,16,17]。Blast在線分析也表明，辣木MoCHS推測的氨基酸序列與其他植物中的CHSs相似性較高，其中與來源于番木瓜、麻風樹等藥用植物的CHSs的相似性均在85%以上，表明該基因與NCBI數據庫中查爾酮合成酶相關基因親緣關系越近。此外，3D結構模型及系統進化分析均證實MoCHS1與其他植物相一致。以上研究結果表明本研究中MoCHS1屬于典型的查爾酮合成酶家族基因。[11?14,19]

本研究首次克隆了辣木CHS1 基因的全長ORF和gDNA序列，將有助于進一步闡明辣木類黃酮人化合物的合成及基調控機制提供科學依據，以期為利用生物技術手段改變植物類黃酮化合物含量，為進一步開發和利用辣木植物資源奠定理論基礎。