基于多成分含量測定結合化學計量學考察延胡索不同加工方法對成分穩定性的影響

范天慈，竇志英*，宋洪偉，任曉亮*，李 捷，溫英麗，劉麗婷

基于多成分含量測定結合化學計量學考察延胡索不同加工方法對成分穩定性的影響

范天慈1，竇志英1*，宋洪偉2，任曉亮1*，李 捷1，溫英麗1，劉麗婷1

1. 天津中醫藥大學，天津市中藥化學與分析重點實驗室，天津 301637 2. 徐州市中醫院，江蘇 徐州 221000

考察不同加工方法對延胡索藥材、飲片長期貯存中成分穩定性的影響，進而選擇合理的加工方法，確保藥材質量。將新鮮延胡索分為大個延胡索（直徑＞1 cm）和小個延胡索（直徑＜1 cm），分別進行個子貨烘干、曬干，切片烘干、切片曬干，水煮、水蒸、醋煮及采用最優工藝醋蒸。通過超高效液相色譜（UPLC）同時測定四氫非洲防己堿、原阿片堿、四氫黃連堿、非洲防己堿、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、去氫紫堇堿8種生物堿含量，結合化學計量學評價不同加工方法對延胡索成分穩定性影響。延胡索藥材及飲片經過18個月貯存后，所測指標性成分延胡索乙素均符合《中國藥典》2015年版規定。烘干、曬干法處理藥材、飲片成分在儲藏過程中下降率大，穩定性差。醋制和蒸煮處理有利于增加延胡索藥材貯藏的穩定性。醋蒸法樣品穩定性好，干燥時間短、效率高，有利于長期貯藏。制備延胡索藥材時宜選用水蒸后烘干，制備醋延胡索飲片時選用鮮品切片后醋蒸法。

延胡索；穩定性；加工方法；四氫非洲防己堿；原阿片堿；四氫黃連堿；非洲防己堿；延胡索乙素；鹽酸小檗堿；鹽酸巴馬汀；去氫紫堇堿；化學計量學

延胡索為罌粟科（Papaveraceae）紫堇屬DC.植物延胡索W. T. Wang的干燥塊莖。其性溫，味辛、苦，歸心、肝、脾經。具有活血、散瘀、行氣、止痛的功效。臨床常使用炮制品，用于治療脘腹疼痛、胸痹心痛和跌打腫痛等[1]。主產于浙江東陽、磐安等地，陜西、河北、山東、江蘇等地亦有栽培[2]。現代藥理學研究表明，延胡索具有鎮痛、保護心血管系統、抗腫瘤、抗菌抗炎等多種作用[3-11]。延胡索傳統的產地加工方法多為采挖后，洗凈置沸水中“煮至恰無白心”時，取出并曬干后進行炮制[12]。《中國藥典》2015年版也沿用此法，《中國藥典》2015年版收載了延胡索凈制法、醋炙法和醋煮法3種炮制方法。延胡索臨床用藥形式主要為醋制品。目前的研究多針醋制對延胡索成分、藥效等方面[13-15]，產地加工對延胡索質量和藥效的影響也有一些，但是尚未見針對延胡索不同加工方法對其貯存穩定性影響的報道。中藥材、中藥飲片作為一種特殊的商品，在應用于臨床之前可能會貯存一定時間或較長時間，貯存期間其質量和藥效可能會受到多種因素的影響而發生變化。因此，有必要對中藥材、中藥飲片的貯存藥效物質穩定性進行考察，并尋找影響其穩定性的產地加工和炮制工序中的影響因素。

本實驗擬考察個子貨烘干、個子貨曬干、切片烘干、切片曬干、鮮品水煮、鮮品水蒸6種產地加工方法以及鮮品醋煮、鮮品醋蒸產地加工和炮制一體化的炮制方法對延胡索質量穩定性的影響。通過檢測延胡索乙素、四氫非洲防己堿、去氫紫堇堿、四氫黃連堿、原阿片堿、非洲防己堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀8種生物堿的含量，將多組分含量和化學計量學方法相結合綜合評價延胡索不同加工方法制備的延胡索藥材和延胡索飲片貯存18個月的變化規律，尋找加工方法對延胡索藥效物質基礎穩定性的影響規律。

1 儀器與材料

UPLC超高效液相色譜儀（安捷倫1290），ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；FW100高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；FA2004電子分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；數顯恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有限公司）；超聲波清洗器KQ-250E（昆山市超聲洗器有限公司）；DHG-9245型鼓風干燥箱（上海躍進醫療器械有限公司）；離心機（北京時代北利離心機有限公司）；FW100高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

四氫非洲防己堿（批號W12N7Z24780）、四氫黃連堿（批號R18A6F2）、非洲防己堿（批號W30M7Z15501）、鹽酸小檗堿（批號Y21A7S13543）均購自上海源葉生物科技有限供公司，鹽酸巴馬汀（批號110732-201611）購自中國食品藥品檢定研究院，延胡索乙素（批號W05-5-8）、去氫紫堇堿（批號W14-2-4）、原阿片堿（批號W14-2-6）均購自Zhongxin Innova Laboratories，所有對照品質量分數均大于98%。醋（天津市天立獨流老醋股份有限公司）；乙腈（默克股份兩合公司）；甲醇（分析純/天津市化學試劑供銷公司）；氨水（分析純/天津市風船化學試劑科技有限公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司），延胡索購于浙江省臺州市仙居縣朱溪鎮，經天津中醫藥大學中藥鑒定教研室馬琳教授鑒定為罌粟科植物延胡索W. T. Wang的干燥塊莖。

2 方法

2.1 延胡索樣品制備

實驗選用產自浙江的新鮮延胡索作為研究對象，對鮮延胡索進行大小分檔，分為2類：大個延胡索（直徑＞1 cm）和小個延胡索（直徑＜1 cm）。具體見表1。

表1 延胡索不同加工方法樣品信息

2.1.1 個子貨烘干 取鮮品延胡索除去雜質，洗凈，75 ℃烘干。

2.1.2 個子貨曬干 取鮮品延胡索除去雜質，洗凈，曬干。

2.1.3 切片烘干 取鮮品延胡索除去雜質，洗凈，切厚片，75 ℃烘干。

2.1.4 切片曬干 取鮮品延胡索除去雜質，洗凈，切厚片，曬干。

2.1.5 水煮 取鮮品延胡索除去雜質，洗凈，加水煮至內無白心，取出，略晾干，切厚片，75 ℃烘干。

2.1.6 水蒸 取鮮品延胡索除去雜質，洗凈，置籠屜中蒸至無白心，取出，略晾干，切厚片，75 ℃烘干。

2.1.7 醋煮 取鮮品延胡索除去雜質，洗凈，切厚片，每100公斤藥材，加入20 kg醋，拌潤，待醋吸盡后，加水煮至內無白心，75 ℃烘干。

2.1.8 醋蒸 依據本實驗組前期實驗篩選出的延胡索產地加工和炮制一體化最優工藝進行制備。取鮮品延胡索除去雜質，洗凈，切厚片，用醋量為10%，拌潤，待醋吸盡后，置籠屜中隔水蒸制至內無白心，75 ℃烘干。

將延胡索藥材、飲片及炮制品密封于小包裝袋內，放置室溫條件下貯藏，分別于0、3、6、9、12、18個月取樣。

2.2 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），0.2%甲酸水（A）-乙腈（B）溶液，體積流量 0.3 mL/min，柱溫55 ℃，檢測波長280 nm，進樣量1 μL；梯度洗脫：0～10 min，12%～14% B；10～14 min，14%～25% B；14～17 min，25%～40% B；17～20 min，40%～45% B；20～21 min，45%～12% B。見圖1。

1-四氫非洲防己堿 2-原阿片堿 3-四氫黃連堿 4-非洲防己堿 5-延胡索乙素 6-鹽酸小檗堿 7-鹽酸巴馬汀 8-去氫紫堇堿

2.3 對照品溶液的制備

精密稱定四氫非洲防己堿、原阿片堿、四氫黃連堿、非洲防己堿、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、去氫紫堇堿分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，得到質量濃度分別為988、1002、990、988、1004、990、996、1000 μg/mL的對照品溶液。量取上述四氫非洲防己堿對照品溶液0.5 mL，原阿片堿對照品溶液0.2 mL，四氫黃連堿對照品溶液1.5 mL，非洲防己堿對照品溶液0.1 mL，延胡索乙素對照品溶液0.5 mL，鹽酸小檗堿對照品溶液0.1 mL，鹽酸巴馬汀對照品溶液0.2 mL，去氫紫堇堿對照品溶液0.5 mL，加甲醇定容至10 mL量瓶中，配成四氫非洲防己堿、原阿片堿、四氫黃連堿、非洲防己堿、延胡索乙素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、去氫紫堇堿質量濃度分別為49.4、20.0、148.5、9.9、50.2、9.9、19.9、50.0 μg/mL的混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

精密稱取延胡索樣品粉末約0.500 g，置平底燒瓶中，精密加入濃氨試液-甲醇（1∶20）溶液50 mL，稱定質量。冷浸1 h后加熱回流1 h，放冷，再稱定質量。用濃氨試液-甲醇（1∶20）溶液補足減失質量，搖勻，4000 r/min離心15 min。精密量取上清液25 mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解。轉移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液即得。

2.5 方法學考察

本課題組前期建立了檢測方法的方法學考察，具體參考宋洪偉等[16]方法，結果均符合含量測定要求，表明精密度、重復性、穩定性良好。

2.6 樣品測定

將延胡索生品及炮制品按“2.4”項下方法制備樣品，按“2.2”項下色譜條件進行含量測定，計算各成分含量。

2.7 統計方法

采用SPSS 23.0和SIMCA-P 14.1統計軟件對數據進行分析

3 結果與分析

3.1 延胡索貯藏18個月過程中生物堿含量及穩定性

樣品儲藏18個月間成分含量見表2，起始含量和儲藏18個月后成分含量的下降率見表3。延胡索藥材及飲片經過18個月穩定性觀察，各成分含量出現不同程度地下降。藥效指標性成分延胡索乙素均符合《中國藥典》2015年版規定。在藥材樣品中，直接烘干和曬干對延胡索乙素影響大，成分下降率大，穩定性差，說明了傳統水煮加工的必要性。在飲片的加工和炮制樣品中，平均下降率大小順序為切片烘干＞切片曬干＞水煮＞水蒸＞醋煮＞醋蒸。飲片經醋煮、醋蒸炮制后儲藏18個月，延胡索乙素含量和儲藏過程中穩定性明顯高于未經炮制樣品，醋蒸法優于傳統醋煮法。

表2 不同延胡索樣品中8種生物堿含量()

續表2

表3 不同延胡索樣品儲藏18個月8種生物堿含量下降率

去氫紫堇堿和四氫黃連堿作為延胡索中主要的藥效成分[17-19]，且含量均較高，變化趨勢明顯。去氫紫堇堿屬于季胺堿，易溶于水，可能在水煮、水蒸、醋煮、醋蒸過程中溶出或分解、破壞。由表2和圖2可見，曬干、烘干樣品貯存起始含量高，S1～S8樣品去氫紫堇堿起始含量在1.792～3.251 mg/g，而S9～S10樣品去氫紫堇堿起始含量在1.234～1.661 mg/g。但曬干、烘干樣品貯藏過程含量下降明顯。藥材經蒸、煮和醋制處理后，會損失部分去氫紫堇堿含量，但能顯著提高成分貯藏穩定性。其中醋制樣品含量下降率低于未炮制樣品，更利于去氫紫堇堿的保存。四氫黃連堿為叔胺堿，屬于水難溶性成分。烘曬樣品在貯藏前期含量顯著下降，呈多次下降、上升的反復趨勢。蒸、煮樣品四氫黃連堿比較穩定，在整個過程緩慢下降，延長了貯藏期。以前9個月儲藏含量變化為例，S1～S8樣品含量下降率在19.98%～27.79%，S9～S16下降率在1.58%～18.89%。其中醋蒸、醋煮法對其穩定性的提升效果優于水蒸、水煮法。僅憑單一成分分析難以全面評價藥材質量，進一步通過多組分結合化學計量學進行綜合考察。

圖2 不同樣品中延胡索乙素、去氫紫堇堿、四氫黃連堿18個月含量變化

3.2 聚類分析

聚類分析可將具有相似特點的樣品歸類[20]。運用SPSS 23.0軟件對延胡索樣品進行系統聚類分析，以貯藏18個月后8種成分下降率為指標，采用組間連接法和歐式距離對數據進行處理，結果見圖3。

圖3 不同加工方法的延胡索樣品聚類分析

經聚類分析可分為2大類：水蒸、水煮、醋煮、醋蒸為第一類，烘干、曬干樣品為另一類，提示經過煮、蒸炮制方法與簡單烘、曬對樣品質量影響差異明顯。再進行具體劃分，水蒸、水煮和醋蒸、醋煮2類，說明了醋對延胡索炮制的重要作用，曬干和烘干區分不理想。

3.3 主成分分析

在聚類分析基礎上，以18個月8種生物堿的下降率為變量，導入SIMCA-P 14統計軟件進行主成分分析，見圖4。其中第1主成分貢獻率為61.7%，第2主成分貢獻率為13.4%。經過水煮、水蒸、醋煮、醋蒸炮制方法樣品與曬干、烘干初加工樣品之間有區分，前者分布在左側，后者聚集在了右側。說明煮、蒸法與直接烘、曬對延胡索藥材儲藏穩定性影響有差異。烘干曬干樣品之間分散錯亂，無法進一步具體區分。水煮、水蒸和醋煮、醋蒸樣品之間有差異，但不明顯。因此，對水煮、水蒸、醋煮、醋蒸樣品進一步主成分分析，挖掘有用信息，見圖5。不同炮制方法得到樣品實現了很好的區分。提示水和醋的不同以及煮、蒸2種不同加工炮制方法對樣品中多組分下降率有顯著差異。主成分分析與聚類分析結果一致。

圖4 不同加工方法的延胡索樣品主成分分析

圖5 延胡索煮、蒸樣品主成分分析

通過藥效指標性成分延胡索乙素和多組分結合化學計量學綜合考察，發現不同加工方法對延胡索穩定性有顯著影響。其中藥材及飲片直接曬干和烘干貯藏后成分損失多，下降率大，藥材質量差。考慮可控性和效率等問題，延胡索產地加工中宜先水蒸，取出后烘干。醋制有利于增加延胡索藥材貯藏的穩定性。采用蒸制處理的藥材及飲片下降率較其他加工炮制方法小，穩定性最好，利于長期貯存。因此，醋蒸法優于傳統醋煮法。基于定量分析數據，綜合聚類分析和主成分分析，可以實現延胡索藥材及飲片穩定性控制。

4 討論

藥材曬干由于受環境、天氣影響，干燥周期長且有效成分損失嚴重。烘干法操作簡便，溫度及環境比較穩定，且適合產地初加工中藥材水煮或水蒸后干燥操作要求。延胡索中四氫非洲防己堿、原阿片堿、四氫黃連堿、延胡索乙素等叔胺堿經水蒸、水煮、醋蒸、醋煮加熱處理后有效成分溶出量增加，其下降率小于生品，且淀粉粒糊化質地變硬且角質樣，更有利于長期貯存。因此，蒸、煮處理與直接烘、曬相比能提升穩定性。采用蒸制處理的飲片及炮制品由于隔水蒸制，延胡索與水接觸面積小，成分損失少，同時干燥時間短、效率高，有效成分含量比煮制高，更有利于貯藏穩定性，建議產地加工時可采用蒸法來制備延胡索藥材。延胡索炮制品中由于炮制輔料醋經陳放過程中產生四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TMP）等美拉德反應產物[21]，具有抗氧化及抑菌作用，同時能與延胡索中生物堿結合成鹽增大溶解度，延胡索經醋制后能增強其貯藏期間的穩定性，故延胡索醋制品較延胡索相比與水加工樣品下降率低，穩定性最好。這也驗證了延胡索醋炙的科學性，建議延胡索鮮品采用切片醋蒸方法制備醋制延胡索飲片，也就是將產地加工和炮制一體化。

本研究通過UPLC測定延胡索中8種生物堿含量，觀察藥效指標性成分延胡索乙素和多組分含量變化，結合聚類分析、主成分分析等化學計量學對不同加工方法對延胡索藥材及飲片穩定性影響做了初步探究。延胡索藥材及飲片經過18個月穩定性觀察，所測指標性成分延胡索乙素均符合《中國藥典》2015年版，但實際有效期還有待進一步分析確定。本研究僅從對儲藏18個月成分穩定性影響方面初步評判加工炮制方法，烘干、曬干過程中不同溫度、濕度、時間等其他工藝因素的影響和對水分、藥材外觀等其他品質影響有待進一步研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on effects of different processing methods ofon stability of components based on multi-component content determination and chemometrics

FAN Tian-ci1, DOU Zhi-ying1, SONG Hong-wei2, REN Xiao-liang1, LI Jie1, WEN Ying-li1, LIU Li-ting1

1. Tianjin Key Laboratory of Traditional Chinese Medicinal Chemistry and Analytical Chemistry, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301637, China 2. Xuzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Xuzhou 221000, China

To explore the effects of different processing methods on the changes of medicinal materials and cut pieces ofin the long-term storage of various medicinal substances, and to select a reasonable processing method to ensure the quality of medicinal materials.Freshwere divided into large(diameter＞1 cm) and small(diameter＜1 cm). Corydalis dried goods, sun dried goods, dried slices, sun dried slices, boiled, steamed, boiled vinegar and steamed using optimum vinegar carried out separately. The content of eight alkaloids, including tetrahydrocolumbamine, protopine, tetrahydrocoptisine, columbamine, tetrahydropalmatine, berberine hydrochloride, palmatine hydrochloride, and dehydrocorydaline were determined by UPLC, and the effects of different processing methods on the stability ofwere evaluated by chemometrics.After 18 months of storage, the index components ofwere in accordance with the regulations of the 2015 edition of. The components of medicinal materials treated by drying and sun drying decreased greatly in the process of storage, and the stability was poor. Vinegar and cooking treatments are beneficial to increase the storage stability of. The vinegar steaming method has good stability, short drying time and high efficiency, which is most beneficial to long-term storage.The preparation ofshould be steamed with water and dried, and the vineger-processed pieces ofshould be prepared by slicing and steaming with vinegar.

; stability; processing methods; tetrahydrocolumbamine; protopine; tetrahydrocoptisine; columbamine; tetrahydropalmatine; berberine hydrochloride; palmatine hydrochloride; dehydrocorydaline; stoichiometry

R286

A

0253 - 2670(2021)13 - 4047 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.028

2020-10-09

中醫藥行業科研專項（201107007）

范天慈（1998—），男，碩士研究生，研究方向為中藥炮制與質量控制。E-mail: Ftc01910@163.com

竇志英，教授，主要從事中藥炮制與質量控制研究。E-mail: zhiyingdou@163.com

任曉亮，教授，主要從事中藥分析研究。E-mail: renxiaoliang@tjutcm.edu.cn

[責任編輯 時圣明]