多花黃精內生菌群落結構多樣性及其與有效成分含量相關性研究

蔡 媛，劉 浩，孔文平，鐘 燦，謝 景，王勇慶，黃建華，張水寒*

多花黃精內生菌群落結構多樣性及其與有效成分含量相關性研究

蔡 媛1，劉 浩1，孔文平2，鐘 燦1，謝 景1，王勇慶1，黃建華1，張水寒1*

1. 湖南省中醫藥研究院 中藥研究所，湖南 長沙 410006 2. 中南大學湘雅國際轉化醫學聯合研究院，湖南 長沙 410000

通過分析多花黃精內生菌菌群結構多樣性及其與主要有效成分含量之間的相關性，探討多花黃精內生菌對其藥材品質的影響。收集不同產地多花黃精樣品，采用高通量測序對內生菌群落結構進行分析，并測定多糖、總皂苷等有效成分含量，通過雙因素關聯分析探究菌群多樣性及其與有效成分之間的關系。5個產地15組多花黃精樣品共得到1 183 635條有效序列，劃分為59 474個操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），其中細菌分19門，47綱，120目，201科，419屬；屬水平上，泛菌屬為優勢菌群，最大占比達到61.1%。真菌分7門，27綱，70目，132科，187屬；屬水平上，子囊菌門一未鑒定屬、赤殼屬為優勢菌群，其中赤殼屬的最大占比達到10.7%。在豐度前10的內生真菌和細菌中，共有10個菌屬與有效物質含量呈顯著相關，其中真菌有2個菌屬呈負相關，1個菌屬呈正相關；細菌2個菌屬呈負相關，5個菌屬呈正相關。通過分析不同產地多花黃精內生菌群落結構及其多樣性，掌握了多花黃精內生菌資源狀況，分析發現內生菌與有效成分之間存在關聯，這為深入探討多花黃精內生菌與其品質的相關性，進而采用生物施肥策略提升品質等提供了科學依據。

多花黃精；內生菌；多樣性；有效成分；高通量測序

多花黃精Hua.來源于百合科黃精屬多年生草本植物，以根莖入藥，具有補氣養陰、健脾、潤肺、益腎等功效[1]，主要分布在湖南、貴州、湖北、江西、安徽等地。多花黃精富含多糖、皂苷、黃酮、生物堿和蒽醌類化合物。現代藥理研究表明，多花黃精具有抗氧化、調節免疫、抗炎等作用。特別是黃精載入藥食同源名錄后，多花黃精可以作為臨床配方、中成藥生產、保健食品配伍、藥膳原料使用，具有廣闊的開發前景及應用價值[2-5]。

研究表明，藥用植物內生菌菌群結構組成隨物種及其基因型、生長環境的不同而不同[6-9]。內生菌以植物為宿主載體，二者相互作用形成微生態系統，影響藥用植物植株生長、病害發生、逆境抗性等[10-14]。同時，內生菌通過物質循環、能量轉換與宿主相互作用進而影響植物內環境氧化還原狀態、酸堿度等特性，促進氨基酸、核酸、碳水化合物等養分的轉換與儲存，加快宿主植物對養分的吸收及代謝，從而提高藥材的品質。目前紅豆杉、人參、丹參、重樓、西洋參等多種植物已廣泛開展內生菌相關研究[15-19]。然而，目前關于多花黃精內生菌結構多樣性相關研究國內外鮮有報道，通過研究多花黃精內生菌的多樣性，整體把握其內生菌資源狀況，尋找可以提高其有效成分含量的內生菌資源，對提高多花黃精藥材品質顯得尤為必要。

相比于平板稀釋涂布法、變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）等，高通量測序具有獲得信息量大、樣品間平行性好等優點，能更真實全面反映樣品中微生物菌群結構，現已廣泛應用于內生菌、根際微生物等研究中[20-21]。因此，本研究采用MiSeq測序平臺，結合生物信息學分析對多花黃精內生菌菌群結構和多樣性進行分析，以期初步探明多花黃精根莖內生菌群體的多樣性特征及其潛在功能。同時測定各樣地多花黃精樣品中有效成分含量，采用雙因素關聯分析探討有效成分含量與內生菌之間的關系，為多花黃精內生菌功能菌株的挖掘和采用生物施肥策略提升品質等提供科學依據。

1 材料與試劑

1.1 材料

依據多花黃精的主要分布區域及5點取樣法原則，選取安徽蕪湖、江西萍鄉、湖北宜昌、貴州貴陽、湖南耒陽5個產地采集3年生（依據莖痕的數量進行判別）健康多花黃精樣品（表1），每個地點采集15株樣品。樣品經湖南省中醫藥研究院生藥室副主任劉浩鑒定為多花黃精Hua.。每個省份的樣品隨機分為3組，每組樣品除去泥沙，分成2份，一份用于總DNA提取測序，一份烘干干燥用于多糖等有效物質含量的測定，含量測定和測序的樣品一一對應。

1.2 儀器與試劑

UV 2500紫外-可見分光光度計（上海第三分析儀器廠）；AUY220型分析天平（日本島津公司）。-葡萄糖（批號110833-201205）、薯蕷皂苷元（批號111539-200001）、5-羥甲基糠醛（5-HMF）（批號111626-201509）、沒食子酸（批號110831-201204）、蘆丁（批號100080-201811）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院，質量分數均大于98%。甲醇、無水乙醇、濃硫酸等其他化學試劑均為分析純。Omega M5635-02 DNA提取試劑盒（美國Omega Bio-Tek公司）。

2 方法

2.1 總DNA提取

取多花黃精的樣品表面除菌后切成2半，從中間掏取多花黃精塊，然后切成小塊并用PBS溶液反復沖洗，取沖洗液于8000 r/min 離心5 min，倒掉上清液，合并沉淀于液氮中凍存后取出立即研磨，參照DNA提取試劑盒說明書進行總DNA的提取。采用瓊脂糖凝聚電泳檢測所提取DNA的純度和濃度。

表1 樣品采集地的地理位置

2.2 目標片段PCR擴增及測序

以微生物核糖體RNA 16S及ITS等能夠反映菌群組成和多樣性的目標序列為靶點，根據序列中的保守區域設計相應引物，并添加樣本特異性Barcode序列對rDNA基因可變區或特定基因片段進行PCR擴增。細菌PCR擴增所用的引物為V3-V4通用引物，338F引物：5’-ACTCCTACGGG- AGGCAGCA-3’；806R引物：5’-GGACTACHVG- GGTWTCTAAT-3’。真菌ITS擴增通用引物，ITS5F引物：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACA- AGG-3’；ITS1R引物：5’-GCTGCGTTCTTCATC- GATGC-3’。測序委托上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

2.3 生物信息學數據分析

根據Barcode序列和PCR擴增引物序列從原始數據中拆分出各樣品數據，截去Barcode和引物序列后使用FLASH對每個樣品的Reads進行拼接、過濾、去除嵌合體序列，得到有效數據（effective tags）。通過QIIME軟件調用UCLUST序列比對工具[22-23]，對獲得的序列按97%的序列相似度進行歸并和操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）劃分，挑選相對豐度最高的OTU代表序列與基因數據庫中的參考序列進行比對，使用RDF分類器對代表序列進行物種注釋，并分別在各個分類水平門（phylum）、綱（class）、目（order）、科（family）、屬（genus）統計樣品每個OTU中的豐度信息，并基于OTU分析計算物種多樣性指數，如菌群多樣性的Shannon指數、菌群豐度指數Chao1指數及測序深度coverage。

2.4 有效物質含量測定

采用蒽醌-硫酸法測定多糖含量，具體參考《中國藥典》2015年版[1]。采用紫外分光光度法測定總皂苷、總黃酮、總酚、5-HMF的含量。

2.5 數據分析

3 結果與分析

3.1 多花黃精內生菌測序序列深度驗證

對多花黃精5個產地（15組）根莖樣品進行高通量測序，質控后獲得高質量序列共1 183 635條。其中細菌547 833條，平均長度分布在360～440 nt，與16 S rDNA V3-V4區序列長度吻合。獲得真菌序列635 802條，平均長度分布在340～360 nt，與ITS rDNA序列長度吻合。按照97%相似性，聚類物種操作分類單元，統計各樣本在不同OTU中的豐度信息（表2）。稀釋曲線反映了樣品的取樣深度，可以用來評價測序量是否足以覆蓋所有類群。各產地OTU稀釋曲線如圖1所示，曲線趨于平坦，各產地OTU覆蓋率均達92.9%～99.9%（表2），說明測序數據量基本合理，真實環境中內生菌群落結構的置信度高，能夠比較客觀地反映不同產地多花黃精樣本的內生菌群落。

3.2 內生菌群操作分類單元OUT及其多樣性分析

Venn圖直觀展示樣本中共有和獨有OTU得數目，從而反映出樣本間OTU組成相似度及共有情況。在OTU水平構建Venn圖對樣本物種組成進行分析。從圖2可以看出，YC內生菌OTU數目最多，LY內生菌OTU數目最少。不同產地多花黃精共有OTU占比較低，內生細菌共有OTU占比為27.1%～48.4%，內生真菌為12.6%～24.8%，說明不同產地多花黃精內生菌群體組成差異明顯。這可能是由于植株內環境受外界環境影響，微生物與植株通過長期協同選擇進化形成的偏好性。

表2 測序數據統計及Alpha多樣性指數()

AH、GZ、JX、YC、LY代號與表1相同，下同

圖2 多花黃精內生細菌(A)和真菌(B) 群體OTU分布韋恩圖

3.3 多花黃精內生菌群落結構和屬水平的優勢種群分析

內生細菌從屬水平來看，按照至少在1個產地中豐度≥10%，所有OTU總共歸于泛菌屬Gavini、假單胞菌屬Migula、腸桿菌屬Hormaeche & Edwards、節桿菌屬Busse、嗜糖假單胞菌屬Xie & Yokota、寡桿菌屬Rapala、志賀氏菌屬Castellani & Chalmers、布魯氏菌屬Meyer & Shaw、不動桿菌屬Brisou & Prévot、貪銅菌屬Makkar & Casida等23個優勢菌屬，具體如圖3所示。其中泛菌屬總豐度最高，且該屬分布于所采集樣品位于的5個省份，在LY樣品中占比最大，為61.12%，YC樣品中占比最小，為0.88%，如圖4所示。還有很多OTU序列未能在屬水平歸類，說明不同產地多花黃精樣品中還存在大量的未知屬。內生真菌從屬水平分析，按照至少在1個產地中豐度≥10%，所有OTU總共歸于子囊菌門下一未知屬unclassified-p-、赤殼屬E. F. Sm、炭疽屬Corda、間座殼屬Nitschke、鐮刀菌屬Link等20個屬。其中子囊菌門下一未知屬占比最大，其次為赤殼屬，且赤殼屬在江西占比最為明顯，達到了10.7%。從圖4對比分析可以看出，多花黃精內生細菌比內生真菌在群落豐富度程度要高，從各樣本中看，細菌優勢菌群占比沒有真菌占比大。

圖3 不同產地多花黃精內生細菌(A) 和真菌(B) 優勢屬組成

圖4 不同產地多花黃精細菌 (A)和真菌(B)優勢物種分布比例圖

3.4 不同產地多花黃精有效成分含量測定

測定不同產地多花黃精中的多糖、總皂苷、總黃酮、總酚、5-HMF含量如圖5所示。《中國藥典》2015年版規定，多花黃精中多糖含量不得低于7%。就多糖含量而言，LY＞JX＞YC＞GZ＞AH，其中LY含量顯著高于其他產地，平均含量達到了20.73%?？傇碥蘸?，GZ＞YC＞AH＞JX＞LY，LY含量最低，平均含量為0.84%。總多酚含量為LY＞AH＞GZ＞JX＞YC?？傸S酮含量為LY＞JX＞AH＞GZ＞YC，各產地間無顯著性差異。5-HMF含量為JX＞GZ＞YC＞AH＞LY，各產地間無顯著性差異。

3.5 多花黃精內生菌菌群與有效成分含量相關性分析

分別選取相對豐度前10的內生細菌和真菌，用皮爾森相關性來研究有效成分含量與物種相對豐度之間的關系，得到二者之間的相關性和顯著性值。由表3分析可知，內生真菌炭疽菌屬與青霉菌屬Link與多糖含量呈顯著性負相關，一未知菌屬與多酚含量呈顯著性負相關，鐮刀菌屬與5-HMF呈極顯著性正相關。內生細菌泛菌屬、腸桿菌屬Hormaeche & Edwards與多糖及總皂苷含量呈顯著性正相關。其中泛菌屬與多糖呈極顯著性正相關，與總皂苷呈極顯著性負相關。假單胞菌屬與布魯氏菌屬與總黃酮含量呈極顯著性正相關。嗜糖假單胞菌屬、布魯氏菌屬、貪銅菌屬與總黃酮含量呈顯著性正相關。不動桿菌屬與5-HMF呈極顯著性正相關。相關性網格圖見圖6。

*P＜0.05表示差異顯著

表3 有效成分與微生物相對豐度Pearson相關性分析

*＜0.05表示顯著相關，**＜0.01表示極顯著相關

*significance at 0.05 level，**super significance at 0.01 level

紅色表示正相關，綠色表示負相關

4 討論

藥用植物在長期選擇進化過程中，不同產地環境氣候因子、內環境等因素賦予其不同品質，植物內生菌是植物內部環境的主力軍，研究藥用植物微生物群落結構組成及其多樣性與有效成分之間的關系，對揭示有效成分含量變化、道地藥材形成機制具有重要意義[24]。目前有關多花黃精內生菌群體的多樣性與有效物質成分含量之間的相關性等研究尚未報道[25]。

本研究利用MiSeq高通量技術，對湖南、安徽、江西、湖北、貴州5個產地15組多花黃精樣品進行細菌16S rDNA V3-V4區和ITS rDNA基因測序，將內生菌菌群相對豐度與絕對定量的微生物數量相結合，客觀、真實、全面的反映了多花黃精內生菌菌群結構及其多樣性?；诟鳟a地OTU及其相對豐度計算Shannon指數和Chao1指數（表2），說明多花黃精根莖中定殖較為豐富的內生菌，這些內生菌不僅數量眾多，而且種類也很豐富。某種程度上，內生菌在宿主植物機體內的生物量代表著其與宿主之間進行著頻繁的信號和物質交流。在本研究15組樣品中，內生細菌的優勢菌屬是泛菌屬，占比最高達到了61.12%，最低0.88%。泛菌屬在植物中廣泛存在，具有作為生防菌、產生植物激素、溶解磷素、生物固氮等作用。研究者從水稻中分離的內生泛菌屬菌株YS19可以分泌生長素、細胞脫落酸、細胞分裂素、赤霉素，對植物的生長發育具有直接促進作用[26]。其次，優勢菌屬為假單胞菌屬，占比范圍為0.5%～33.67%。假單胞菌是一類重要的內生菌微生物，能夠產生活性物質或者改善礦質營養直接促進植物生長，或者其代謝產物或競爭作用抑制或阻礙其他病原微生物的發生發展，間接促進植物的生長[27]。本研究中相對豐度較高的內生細菌菌屬還有腸桿菌屬、節桿菌屬Busse、鮑氏桿菌屬r Rapala和大腸桿菌志賀菌屬Castellani & Chalmers等。內生真菌的優勢菌群為子囊菌門下一未知鑒定菌屬，其次為赤殼屬、炭疽屬、間座殼屬、鐮刀菌屬等。眾所周知，在根和根莖類藥材栽培種植過程中，易患根腐病，其具有易傳染、致死率高、防治難度大等特點。致病菌是根腐病發生發展的關鍵所在。本研究測序發現多花黃精內生真菌群落中含有炭疽屬、鐮刀屬等常見致病菌菌屬，這為多花黃精栽培種植過程中農業防治方面提供了參考依據。

藥用植物的有效成分含量直接對應中藥材的品質及其在臨床的療效，是評價藥材品質的主要標準。對藥材而言，其產地生態環境因子、內環境因子等是中藥有效成分生物合成的反應條件，與中藥材質量及其道地性等緊密相關。內生菌作為其內環境主要影響因素，參與藥材質量形成過程，且發揮著重大作用。Kumar等[28]研究者在姜黃根莖接種圓褐固氮菌能夠顯著提高姜黃根莖生物量及姜黃素的含量，其中姜黃素的含量提升達到了6%。Tiwari等[29]對長春花外植體接種其內生菌，顯著增強了長春花堿、苦艾堿等有效成分的含量。本研究采用皮爾森相關分析方法，將多花黃精內生菌優勢菌群與其有效成分多糖、總黃酮、總皂苷、總多酚、5-HMF含量進行相關性研究。采用Cytoscape軟件繪制豐度排名前10的優勢內生菌與有效成分雙因素相關性網絡圖，更直觀地反映出優勢菌群與有效成分含量之間的相關性，從圖6可以看出，菌群與有效成分含量之間關聯錯綜復雜，同一菌群可與不同種類的有效物質關聯。如菌與多糖含量之間存在正相關，卻與總皂苷之間存在負相關，這可能是該優勢菌群參與了成分的分解代謝，改變了碳代謝流的方向。不同菌群之間也存在相互影響進而共同影響有效成分的含量，其具體機制值得進一步研究。

本研究初步顯示多花黃精根莖內定殖種類豐富的內生菌菌群，其與多花黃精有效成分含量關系密切，證明內生菌在多花黃精生長發育及其代謝過程中參與了多花黃精藥材品質的變化，值得進一步研究。進一步的工作將重點從以下幾個方面進行：（1）繼續挖掘不同條件下多花黃精內生菌資源，完善其分離分類鑒定方法，建立健全的內生菌物種資源庫。通過橫向比較分析，探究其內生菌群地理分布規律，為深入探索藥材道地性奠定基礎。（2）分離多花黃精內生菌菌株，通過內生菌消除、回染實驗等分析驗證優勢菌群對多糖、皂苷等有效成分含量的影響及其相關作用機制。（3）建立活性菌株、抗重金屬等特性菌株篩選體系，分離內生菌菌株，評估其活性成分生產及抗重金屬能力，篩選獲得具有藥用應用化生產潛力、減低重金屬聚積等具有開發實用價值的菌株。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on community and diversity of endophyte and its correlation with active ingredient content in

CAI Yuan1, LIU Hao1, KONG Wen-ping2, ZHONG Can1, XIE Jing1, WANG Yong-qing1, Huang Jian-hua1, ZHANG Shui-han1

1. Institute of Traditional Chinese Medicine, Hunan Academy of Chinese Medicine, Changsha 410006, China 2. Xiangya International Academy of Translational Medicine, Central South University, Changsha 410000, China

To explore the effect of endophyte on the quality ofby analyzing the correlation between community and diversity of endophyte and the content of active ingredient.from different locations were collected; High-throughput sequencing technology was used to analyze endophyte and the content of active ingredient were determined, including polysaccharides, total saponins and so on. The relationship between the diversity of endophyte and the active components was explored through two-factor correlation analysis.The results showed that 1 183 635 effective sequences were obtained from 15 samples ofin five different places, which were divided into 59 474 operational taxonomic units (OTUs). The endophytic bacteria were divided into 19 phyla, 47 classes, 120 orders, 201 families, and 419 genera among them. At the genus level, Pantoea was the dominant genus, which the largest proportion amounted to 61.1%. The endophytic fungi were divided into 7 phyla, 27 classes, 70 orders, 132 families, and 187 genera. At the genus level, an unidentified genus from Ascomycota and Neocosmospora were the dominant genus, the largest proportion of Neocosmospora reached 10.7%. Among the abundance ratio of the top 10 endophytic fungi and bacteria, a total of 10 genera were significantly correlated with the content of active ingredients, which were two negative correlation and one positive correlation in fungi genus. Two and five genera of bacteria were negatively and positively correlated, respectively.The results master the endophyte resources ofby analyzing the community and diversity of endophyte from different habitat samples. It is showed that there is an interaction between endophyte and active ingredient. The present analysis provides a scientific basis for in-depth discussion of the interaction mechanism between endophyte and character of, and the use of biological fertilization strategies to improve quality in the future.

Hua; endophyte; diversity; active ingredient; high-throughput sequencing

R282

A

0253 - 2670(2021)13 - 4023 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.025

2020-11-06

國家自然科學青年基金項目（81503197）；湖南省自然科學青年基金項目（2018JJ3310）；湖南省中醫藥管理局項目（201810）；湖南省中醫藥研究院自主項目（201705）；湖南創新型省份建設科技扶貧政策性項目（2019NK3010-02）

蔡 媛，助理研究員，研究方向為中藥學。E-mail: tcmyuanyuan@163.com

張水寒，研究員，研究方向為中藥學。E-mail: zhangshuihan0220@126.com

[責任編輯 時圣明]