Exendin-4螺旋結構對生物活性及穩定性的影響

宋相偉 , 竇馨月, 沙 悅, 羅 銳, 王雪麗

(1.長春師范大學 生命科學學院, 長春130032； 2.吉林工商學院 糧食學院, 長春130507)

Exendin-4是由一種希拉毒蜥唾液腺分泌的39肽[1], 與人體內胰高血糖素家族具有高度同源性. Exendin-4與胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1 R)結合可發揮獨特的降血糖作用[2-3], 目前已被美國禮來公司開發成為Ⅱ型糖尿病治療藥物——艾塞那肽[4-5]. 文獻[6-8]研究表明, Exendin-4在治療神經退行性疾病及新生兒神經系統障礙疾病等方面作用顯著.

Exendin-4結構由三部分組成： N端的無規則卷曲結構, 中心區域的α-螺旋結構以及C端的Trp-Cage結構. 其中N端無規則卷曲主要負責激活受體[9]；α-螺旋結構主要負責與GLP-1受體結合, 分為N端螺旋(9～15位氨基酸)和C端螺旋(19～27位氨基酸)兩部分, 負責與GLP-1受體胞外區N端相互作用, 是與受體相互作用的主要區域, 占總結合力的79%, 第22位的Phe參與激活受體[10]； Trp-cage結構可穩定螺旋結構, 幾乎不參與激活受體.

Exendin-4的水溶性差、 易聚集等特性限制了其更好地發揮生物活性作用. 本文以去除和替換的方式對Exendin-4的N端和C端α-螺旋進行結構改造, 設計了結構類似物ExA，ExB，ExC，ExD, 以進一步研究 Exendin-4螺旋結構與其生物活性和穩定性的關系, 為設計篩選高活性Exendin-4結構模擬物提供結構信息, 最終為糖尿病和神經退行性疾病藥物的開發提供先導化合物.

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

胰島β細胞系RINm-5F(美國ATCC細胞庫， 編號： CCTL-11605)； 培養基RPMI-1640(美國GIBCO公司)； 小牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)； 四甲基偶氮唑鹽(MTT, 美國Sigma公司)； 二肽基肽酶Ⅳ(DPPⅣ, 美國Sigma公司). 圓二色譜儀(Jasco J-810型, 日本島津公司)； 熒光光譜儀(RF-5301PC型, 日本島津公司).

1.2 實驗過程

1.2.1 Exendin-4及類似物的合成

Exendin-4及類似物由上海吉爾生化有限公司合成.

1.2.2 圓二色譜檢測

圓二色(CD)波長范圍185～270 nm， 速度20 nm/min， 狹縫寬度 2 nm， 4次掃描， 響應時間4 s， 溫度25 ℃; Exendin-4及模擬物用磷酸鹽(PBS)緩沖液配制成50 μmol/L溶液； 數據處理用Origin 9.0軟件(美國OriginLab公司)繪制波長毫度曲線.

1.2.3 熒光光譜分析

激發波長設為297 nm, 發射波長掃描模式范圍設為300～510 nm, 狹縫寬為5 nm； 樣品制備方法與圓二色譜樣品制備方法相同； 數據處理用Origin 9.0軟件繪制熒光譜.

1.2.4 生物活性檢測

以2×104個細胞/孔的密度將胰島β細胞RINm-5F接種于96孔板上； 37 ℃,φ(CO2)=5% 培養12 h后加入Exendin-4及結構模擬物, 繼續培養48 h； 加入10 μL MTT(5 mg/mL)于37 ℃孵育4 h； 吸出上清液后加入二甲基亞砜(DMSO)100 μL/孔完全溶解結晶； 利用酶標儀在490 nm/630 nm波長下檢測.

1.2.5 穩定性檢測

用pH=8.0 Tris-HCl將Exendin-4 及模擬物配制為25 μmol/L, 分別向模擬物中加入適量的DPPⅣ酶, 37 ℃孵育48 h后取樣, 用等體積的體積分數為10%的三氟乙酸(TFA)終止反應.

樣品經1 mL C18固相萃取柱預處理后， 用C8柱反相高效液相進行分析, 檢測波長214 nm. 根據不同時間點的峰面積計算剩余Exendin-4以及模擬物的百分數.

1.2.6 數據分析

用Origin 9.0軟件對數據進行繪圖和統計學分析. 生物活性檢測實驗結果用平均數表示, 每個實驗重復3次, 顯著性差異用P值表示, 其中*P< 0.05, **P<0.01, ***P<0.001被認為有統計學意義； ns為無顯著差異.

2 結果與討論

2.1 模擬物設計

為研究N端螺旋與生物活性及穩定性關系, 設計模擬物ExA和ExB： 將Exendin-4 的N端螺旋(9～15位氨基酸)去除即為ExA； 將Exendin-4 的N端螺旋(9～15位氨基酸)用3個連續的Ala替換即為ExB. 為研究C端螺旋與生物活性及穩定性關系, 設計模擬物ExC和ExD： 用3個連續的Ala替換Exendin-4的C端螺旋(19～27位氨基酸)即為ExC； 在ExC基礎上將第13位Gln替換為Tyr即為ExD. Exendin-4模擬物序列列于表1.

表1 Exendni-4模擬物序列

2.2 圓二色譜檢測結果

利用圓二色譜分析模擬物α-螺旋結構的變化， 結果如圖1所示. 由圖1(A)可見， Exendin-4、 ExA和ExB在191 nm處均有正峰, 在221～222 nm和207～210 nm處有2個負峰, 是標準α-螺旋CD圖譜. 螺旋的百分數及穩定性列于表2. 由表2可見， 由于N端螺旋的缺失, 導致ExA的峰值最低, 在4個模擬物中螺旋百分數最低(32.9%), 與預期設計結果相符； 由于ExB 用多聚Ala形成的螺旋替代了原有N端螺旋, 因此α-螺旋的百分數沒有降低(82.4%), 甚至高于Exendin-4螺旋的百分數.

圖1 Exendin-4模擬物的圓二光譜Fig.1 Circular dichroism spectra of Exendin-4 mimetics

表2 α-螺旋的百分數及穩定性

結構模擬物ExB與ExA相比, 因可形成螺旋結構的3個Ala彌補了原有N端螺旋的缺失,α-螺旋的百分數仍可保持原有水平, 通過促胰島細胞增殖生物活性檢測可知, 其生物學活性仍保持原有水平, 甚至在高濃度下具有更顯著的促胰島細胞增殖活性. 因此, 結合ExA與ExB的CD圖譜以及促胰島細胞增殖活性數據可以推斷, 保持N端α-螺旋結構是維系其生物活性的必要條件, 但N端螺旋序列并未呈現特異性要求.

由圖1(B)可見， ExC和ExD均存在α-螺旋結構, 螺旋的百分數與Exendin-4相當, 表明C端螺旋可通過易形成螺旋的3個Ala進行替換, 以維系Exendin-4原有結構構象； 另一方面, 因在ExD中的13位將Gln替換為Tyr, 導致ExD的峰值高于ExC, 即ExD螺旋略高于ExC螺旋的百分數, 表明Tyr13有助于螺旋的形成. 文獻[9]研究表明， 在GLP-1的 N端序列中, 第1位His、 第6位Phe和第13位Tyr形成的穩定疏水簇可與GLP-1受體疏水性口袋相互作用, 其中位于α-螺旋表面的Tyr13是與受體相互作用的接觸點之一, Tyr13可視為結合和激活受體的關鍵氨基酸. ExD和ExC的CD結果進一步證明, 將第13位替換為胰高血糖素家族中保守的Tyr13時更有利于形成α-螺旋結構, 是優化Exendin-4的重要位點.

2.3 熒光光譜分析結果

在 Exendin-4的C端(31～39位氨基酸)存在一個以第25位氨基酸Trp為中心的籠狀疏水簇, 稱為Trp-cage結構. 因此, 利用Trp熒光光譜變化可監測Trp-cage的結構變化. Exendin-4模擬物的熒光光譜如圖2所示. 由圖2(A)可見： ExA的峰位在353 nm處, 與Exendin-4峰位350 nm相比發生了3 nm紅移, 表明Trp-cage結構中心的Trp更趨向暴露于親水環境, Trp-cage結構趨于疏松, 表明去除N端螺旋影響了C端Trp-cage結構的穩定性； ExB與Exendin-4的峰位相同, 仍在350 nm處, 表明Trp-cage結構未發生改變. 因此3 個Ala形成的螺旋結構代替原N端螺旋后, 未對Exendin-4末端Trp-cage結構的穩定性產生影響. 由圖2(B)可見： ExC的峰位在352 nm處, 與Exendin-4峰位350 nm相比發生了2 nm紅移, 表明Trp-cage結構變疏松, 趨于親水, 因此C端螺旋結構更接近Trp-cage結構, 由于對螺旋中氨基酸的種類和順序有一定要求, 因此比N端螺旋更易影響Trp-cage結構的穩定狀態； 另一方面, 由于將第13位Gln替換為Tyr, 使ExD的熒光光譜相對于ExC熒光光譜發生了24 nm藍移； 此外, ExD相對于Exendin-4的峰位發生了22 nm的顯著藍移， 表明引入Tyr有助于Trp-cage結構更緊湊, 進一步證明了Tyr13對于維系Trp-cage的緊湊結構具有重要作用.

圖2 Exendin-4模擬物的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of Exendin-4 mimetics

2.4 生物活性檢測結果

Exendin-4具有刺激胰島β-細胞增殖及抑制胰島β-細胞凋亡的生物活性. 利用MTT法檢測Exendin-4及模擬物對胰島細胞數量的影響, 結果如圖3所示. 由圖3可見， 4種Exendin-4結構模擬物均具有促RINm-5F細胞增殖的活性, 其中ExC與ExD在40～200 μmol/L濃度內的活性顯著高于原始肽Exendin-4.

圖 3 Exendin-4模擬物體外細胞活性檢測Fig.3 Bioactivity test of cell of Exendin-4 mimetics in vitro

在胰高血糖素家族中, 氨基酸序列具有較高同源性, N端His1,Phe6和N端螺旋上的Tyr13均為保守氨基酸位點, 它們可形成一個疏水簇, 是激活受體的主要結構. 與胰高血糖素家族相比, Exendin-4的N端第1位和第6位同樣具有保守氨基酸His,Phe, 模擬物ExA與Exendin-4同樣具有保守氨基酸His1和Phe6, 由于缺少N端螺旋部, 影響了與N端無規則卷曲部分保守氨基酸形成激活GLP-1受體的疏水簇, 因此ExA生物活性降低. 當Exendin-4的N端螺旋用3個Ala替代時(ExB), 仍能保持螺旋構象, 但此時N端螺旋的序列中缺少與N端無規則卷曲部分相互作用的氨基酸, 激活受體的疏水簇不能有效形成, 使其活性小于Exendin-4活性. 因此, N端螺旋是否存在以及螺旋的一級結構信息與Exendin-4的生物活性有直接關系.

當保留N端螺旋序列, 用3個Ala替代C端序列(ExC)時, N端螺旋與N端無規則卷曲區域仍能有效形成疏水簇激活受體, 因此活性未下降. 在ExC和ExD中, 由3個Ala形成螺旋結構的柔韌性可能優于原螺旋序列, C端螺旋結構的優化可能使整個結構與GLP-1R結合自由度發生了改變, 空間定位的變化使配體可更有效地激活受體. ExD中引入Tyr13促使螺旋含量和促胰島細胞增殖活性顯著上升, 推測增殖活性的升高可能與Tyr13能夠和N端His1，Phe6更好地形成疏水簇激活受體有關.

2.5 穩定性檢測結果

DPPⅣ酶是一種生物體內常見的酶, 其主要作用是分解體內蛋白質, 利用DPPⅣ酶進行穩定性實驗可部分反映多肽模擬物在體內的穩定性. 由表2可見, 針對N端螺旋設計的模擬物ExA和ExB, 穩定性ExB>ExA, 穩定性與螺旋的百分數存在一定的正相關性； 針對C端螺旋設計的模擬物ExC和ExD, 在ExC的基礎上引入了胰高血糖素家族中在第13位高度保守的Tyr, 使螺旋的百分數小幅度增加, 穩定性大幅度提高(22%), 即ExD>ExC, 穩定性與螺旋的百分數也存在正相關性.

為進一步了解N和C端螺旋與穩定性的關系, 對ExB和ExC螺旋的百分數和穩定性數據進行分析, ExB和ExC分別用3個Ala的螺旋替換原N和C端螺旋, 螺旋的百分數基本相同, 但穩定性差別較大, ExB比ExC穩定性高51%, 可見C端螺旋被替換后對穩定性影響較大, 表明C端螺旋序列比N端螺旋序列對于Exendin-4的穩定性影響更大.

綜上所述, 由于N端螺旋參與激活受體疏水簇的形成, 因此N端的變化極易削弱Exendin-4的生物活性； C端螺旋氨基酸序列信息的特異性對Exendin-4 在DPPⅣ酶環境的穩定性影響大于N端螺旋序列； 將13位的Gln替換為胰高血糖素家族保守的Tyr有利于提高螺旋的百分數, 促進與N端無規則卷曲區域形成疏水簇增強激活受體的能力, 是Exendin-4序列可進行優化的重要位點.