艾灸 “足三里” 和干姜水提取液對正常大鼠胃能量代謝作用機制差異研究＊

陳麗梅，王 慧，張高傳，劉紅寧＊＊

（1.江西中醫藥大學中醫基礎理論分化發展研究中心 南昌 330004；2.江西省中醫病因生物學重點實驗室 南昌 330004；3.江西中醫藥大學高等研究院 南昌 330004）

艾灸是艾絨燃燒作用于機體特定的穴位，通過光、熱、芳香效應及燃燒灰燼等綜合作用，通過對機體的血液運行[1-5]、神經內分泌功能[6]、能量變化[7]、抗自由基[8]等作用調節機體的生理和心理，起到保健和治療疾病的功能。艾絨燃燒時會釋放出遠紅外和近紅外光譜，遠紅外主要通過傳導擴散熱量，近紅外可直接穿透到機體深層組織，使組織電子發生遷移，在這個過程中會產生大量的能量，同時將能量從一處傳到另一處，為細胞代謝和免疫功能提供能量基礎。研究發現，適宜溫度刺激可提高內皮細胞能量物質，提升其生長活力[9]，說明艾灸可引起細胞的能量變化。而能量代謝是機體物質代謝的基本形式，是維持機體生命活動的物質基礎。足三里穴為足陽明胃經的合穴，胃經氣血在此處形成較大的氣血場，具有燥化脾濕，生發胃氣之效。以前的臨床和實驗研究都是以疾病為載體，然而艾灸足三里除了可以作用于疾病狀態，對正常機體也有益處。我們想知道艾灸足三里后，其對正常大鼠胃組織能量相關因子的影響，以及影響能量代謝的相關代謝物基礎，同時為艾灸溫熱特性提供理論依據。干姜，性熱，主入脾胃經，具有補脾陽作用。研究發現，熱性中藥可增強機體能量代謝[10-11]。本文通過比較艾灸 “足三里” 和干姜對胃組織能量代謝作用機制差異，來窺探體外艾灸補陽和口服藥物補陽之間的異同。代謝組學是系統生物學的重要分支，可從整體上反映機體的受外部刺激后，機體出現的微妙代謝變化。故本文采用代謝組學的技術，探討艾灸足三里穴和干姜對胃組織能量代謝的影響及其作用機制。

1 方法

1.1 干姜提取液的制備

稱取干姜1 kg，加10倍量純凈水浸泡60 min，快速加熱至微沸后開始計時，加熱回流提取1 h，過濾，剩余藥渣加入8倍量純凈水加熱至微沸后繼續加熱回流40 min，合并2次濾液，真空濃縮至1 g·mL-1，-20℃保存備用。

1.2 實驗動物

健 康Sprague Dawley（SD）大 鼠24只（Specific pathogen Free，SPF級），雄性，體質量（160±20）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK（湘）2016-0002。實驗動物飼養條件：SPF級動物房，相對濕度為55%-65%，溫度在（24±2）℃，照明條件為光照-黑暗交替各12 h，自由飲水。艾條（艾絨比8∶1，直徑8 mm）購于江西鄱艾生物科技有限公司。普通飼料購于江西中醫藥大學動物中心。大鼠適應性喂養1周后，將大鼠隨機分為3組，分別為空白對照組、艾灸足三里組、干姜組。艾灸組將大鼠固定在大鼠固定器上，根據大鼠喜暗的習性，蒙住大鼠的雙眼，以便減少運動。艾灸雙側足三里，每天1次，每次 15 min，并灌胃生理鹽水，連續4周；干姜組每天灌胃生藥1.05 g·kg-1的干姜水提液，并除了不艾灸，其他過程和艾灸組一樣，對照組除了不艾灸，其他過程均與艾灸組和干姜組一致。

1.3 樣品的收集

實驗結束后，大鼠禁食不禁水12 h。大鼠麻醉后，腹主動脈取血，將血液在室溫下靜置2 h-3 h，4℃條件下3500 rpm離心10 min。取血結束后，取胃組織，放入液氮中猝滅，然后轉移至-80℃冰箱保存，備用。每個實驗指標均選取同一部位的組織進行檢測。

1.4 大鼠胃組織Na+-K+-ATP、Ca2+-ATP、Mg2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、SDH活性的測定

準確稱取0.1 g胃組織，加入9倍量的生理鹽水，制成10%的勻漿液，1500 rpm離心10 min，取上清液按照試劑盒說明書進行。

1.5 體質量變化和體溫變化

稱量實驗前和實驗結束后所有大鼠的重量及測量實驗前后肛溫。

1.6 肝腎功能的影響

按照試劑盒說明書檢測大鼠血清AST、ALT、Cr、BUN、UA。試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.7 代謝組學樣品的處理

將血清從-80℃冰箱中取出，在4℃條件下解凍。取50μL血清，加入150μL甲醇，渦旋2 min使其完全混勻，在低溫下放置3 h。然后，將血清在4℃條件下以15000 rpm離心10 min，吸取上清液并離心濃縮使其干燥。將殘渣用甲醇∶水=（15∶85）溶解，混勻。取上清液用于UHPLC-Q-TOF/MS分析。從每個樣品中取出10μL，并混合在一起作為質量控制樣品，每5個樣品注入一針質控樣品以監控整個實驗。LC-MS的總離子色譜法在正負掃描模式下進行。

1.7.1 色譜條件

ACQUITY UOLCBEH C18（1.7μm，2.1 mm×5 mm，Waters公司），使用Agilent 1200 System（美國安捷倫）進行色譜分離。自動進樣器保持在4℃，色譜柱溫度在35℃。流速保持在0.3 mL·min-1。UPLC流動相由0.1%的甲酸水溶液（溶劑A）和乙腈（溶劑B）組成。梯度洗脫的步驟如下：0 min-6 min，2%-20%B；6 min-8 min，20%-40%B；8 min-12 min，40%-67%B；12 min-22 min，67%-100%B；22 min-23 min，100%-2%B，23 min-24 min，2%-2%B。

1.7.2 質譜條件

Agilent 6538飛行時間質譜儀對血清樣品進行正負離子模式分析。采用Dual ESI源，正負離子源模式下：毛細血管電壓（Capillary voltage）4000 V（正模式），3500 V（負模式）；霧化器壓力30 psig；干燥氣流10 L·min-1；干燥氣溫度300℃，碎片電壓（Fragmentor）175 V；錐孔電壓65 V，儀器采用參比自動校正，參比液速度為55 ul·min-1，參比離子質荷比為121.05973和922.09798。

1.7.3 數據采集和數據分析

運用Profinder B.0 6.0對原始數據進行預處理，首先采用無監督的主成分分析（Principal component analysis，PCA）對數據進行分析，進行Student’st-檢驗和方差分析以及數據轉換分析（FC），滿足P<0.05且FC>2的變量作為潛在生物標志物。如果PCA分析分離不好，則選擇PLS-AD進行分析，將VIP>1、P<0.05和FC>2作為生物標志物的篩選條件。

將分析得到的分子量和保留時間，結合METLIN（http://www.metlin.scipps.edu）、HMDB（www.hmdb.ca）等數據庫，對化合物的結構進行鑒定，將最終得到的鑒定物輸入 MetaboAnalyst 4.0（http://www.metaboanalyst.ca/faces/ModuleView.xhtmL）分析平臺進行代謝通路分析。

1.8 統計分析

使用SPASS17.0統計軟件，通過單因素方差分析（ANOVA）對結果進行統計學分析，P<0.05被認為具有統計學意義。所用數據均用±s表示。

2 結果

2.1 體質量、體溫變化

與空白對照組相比，艾灸足三里組和干姜組大鼠的體溫沒有顯著性變化（P>0.05），體質量顯著下降（P<0.01）（表1）。

表1 艾灸足三里大鼠體質量體溫變化(n=8,xˉ±s)

2.2 艾灸足三里和干姜水提液對肝腎功能的影響

結果顯示，與空白組對照組相比，艾灸足三里組及干姜組大鼠ALT、AST、UA、BUN、Cr沒有顯著性變化（P>0.05），說明連續艾灸足三里及給予干姜水提液對正常大鼠的肝腎功能沒有顯著影響（表2）。

表2 艾灸足三里和干姜水提液對肝腎功能影響(n=8,xˉ±s)

2.3 艾灸足三里和干姜水提液對胃ATP酶活性、SDH活性的影響（n=8，xˉ±s）

與空白對照組相比，艾灸足三里組能提高正常大鼠胃Na+-K+-ATP酶，Mg2+-ATP酶，Ca2+-ATP酶，Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，且都達到顯著水平（P<0.01）。干姜組大鼠Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶沒有顯著性差異（P>0.05），可顯著提高Mg2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性（P<0.01）。說明艾灸足三里和給予干姜水提取液后，大鼠的能量消耗增加。

同時，與空白對照組相比，艾灸組和干姜組大鼠胃組織SDH活性也顯著提高（P<0.01）。（圖1）。由結果可知，艾灸 “足三里” 和給予干姜水提液既增加大鼠的能量消耗也增加了能量生產，影響機體的能量代謝。

圖1 艾灸組及干姜組對胃ATP酶、SDH活性的影響

2.4 艾灸足三里和干姜水提液對大鼠血清代謝模式的影響

PCA結果顯示，艾灸足三里組和干姜組在正離子模式下兩組代謝物分離的較好，組內聚集程度較好，說明艾灸 “足三里” 及灌胃干姜水提液后大鼠的內源性物質與正常對照組相比發生了顯著性的變化。負離子模式下，兩組代謝物分離不是很好，故對數據進行PLS-DA分析，在PLS-DA模式下，兩組代謝物分離效果較好（圖2、圖3）。

圖2 艾灸足三里組代謝模式圖

圖3 干姜組代謝模式圖

2.5 潛在生物標志物的篩選及鑒定

通過代謝物精確的質荷比和同位素比例，從正離子模式下提取m/z 544.3401的離子，得到相應的保留時間和色譜峰，通過分子特征提取，分子式在MassHunter中得分比較高，在二級質譜中主要有m/z 86.0980、m/z 184.0751、m/z 258.1111、m/z 287.2373、m/z 361.2758、m/z 526.3298的碎片，通過HMDB數據庫鑒定內源性代謝物，將二級質譜的碎片與HMDB數據庫的碎片進行匹配，發現與2-花生四烯酸甘油磷酸膽堿的標準化合物圖譜最吻合，因此被鑒定為2-花生四烯酸甘油磷酸膽堿（圖4）。用上述方法最后鑒定了艾灸 “足三里” 后有5個潛在生物標志物，分別為N-乳代亮氨酸、2-花生四烯酸甘油磷酸膽堿、PC(20:2(11Z,14Z)/14:0)、異亮氨酸、D-谷氨酰胺，其中異亮氨酸、N-乳酸酰亮氨酸、D-谷氨酰胺含量下降，2-花生四烯酸甘油磷酸膽堿、PC(20:2(11Z,14Z)/14:0)含量升高。給予干姜提取液后有5個潛在生物標志物，分別為黃嘌呤、視黃酯、2-花生四烯酰甘油磷酸膽堿、花生四烯酸、3-羥膽酸，其中2-花生四烯酰甘油磷酸膽堿含量升高，視黃酯、花生四烯酸、嘌呤含量下降。

圖4 2-花生四烯酸甘油磷酸膽堿二級質譜圖

2.6 生物標記物代謝通路分析

將已鑒定的生物標記物導入MetaboAnalys 4.0進行Pathway Analysis分析，結果顯示，艾灸足三里穴涉及的代謝通路包括D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成和降解、甘油磷脂代謝、花生四烯酸代謝、氨酰基-tRNA的生物合成，其中纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，甘油磷脂代謝為主要的代謝途徑。給予干姜水提液涉及的代謝通路為視黃醇代謝、花生四烯酸代謝、嘌呤代謝、不飽和脂肪酸代謝的生物合成（圖5）。

圖5 對機體代謝途徑的影響

3 討論

在特定穴位上艾灸會出現明顯的溫度傳導，如果穴位局部溫度升高，熱量會在血液中傳遞[12]，推測艾灸可能是通過加熱補充細胞的能量。盧圣鋒等認為，艾灸在引起組織溫度變化的過程，實際上就是能量傳遞的過程[13]。從整體觀上來說，能量代謝是生命系統的基本過程，而熱是能量代謝的重要表現形式[14]。能量代謝包括能量的產生和利用兩方面。ATP（腺苷三磷酸）酶與能量的利用有密切的關系[15]。細胞膜兩側的離子濃度及離子轉運需要利用能量來維持，ATP酶活性升高的同時也增加ATP的利用。艾灸足三里和給藥干姜均可提高胃的ATP酶活性，說明體外輸入熱量和口服熱性干姜均可增加機體胃組織能量消耗。SDH（琥珀酸脫氫酶）是三羧酸循環中的重要的酶，其活性升高說明三羧酸循環加快，能量生成升高。艾灸足三里和給藥熱性中藥干姜后，SDH活性升高，說明兩種方式均能促進機體三羧酸循環，使機體能量產生增加。

代謝組學結果顯示，艾灸足三里主要通過氨基酸代謝、脂質代謝來影響胃的能量代謝。N-乳代亮氨酸是苯丙氨酸的乳酰基衍生物，是乳酸和亮氨酸通過逆蛋白水解快速形成，其在血清內水平與乳酸和亮氨酸的水平強烈相關。亮氨酸和異亮氨酸屬于支鏈氨基酸，是潛在的營養信號分子。亮氨酸可調節糖代謝、脂肪合成與分解，提高胰島素敏感性，促進能量代謝[16-18]，參與機體產熱等重要的生物學過程。研究表明，脂肪組織通過改變GLUT4（葡萄糖轉運蛋白4）表達而引起支鏈氨基酸酶表達變化，和協同分解循環BCAA（支鏈氨基酸），從而能夠調節支鏈氨基酸的水平[19]。在健康的大鼠中，支鏈氨基酸吸收和氧化發生在多個不同的組織[20]，其一旦進入細胞，BCAA既可以儲存在氨基酸池，也可以被整合到蛋白之中，或者被送到線粒體中進行氧化，也可用于合成酮體和葡萄糖。BCAA在BCATc（胞質支鏈轉氨基轉移酶）和BCATm（線粒體支鏈氨基轉移酶）的催化下發生可逆的轉胺反應生成BCKAs（支鏈α-酮酸）。BCAT（支鏈氨基轉移酶）的表達受到轉錄因子KLF15（糖皮質激素激活）和PGC-1α（過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α）的調控。BCKAs進入多亞基酶復合物BCKDH（支鏈酮酸脫氫酶）氧化反應，該酶的亞基BCKDHA和BCKDHB受PGC1-a和PPAR（過氧化物酶體增殖劑激活受體）家族蛋白的正向調節。線粒體解偶聯蛋白2和解偶聯蛋白3正向調節BCAAs[21]。BCAT催化氨基從BCAAs轉移到α-酮戊二酸形成谷氨酸，然后與丙酮酸結合，通過丙氨酸氨基轉移酶生成丙氨酸，參與到TCA循環中。BCAA的水平會影響TCA（三羧酸循環）循環的中間體，從而影響能量代謝。另一方面，支鏈氨基酸在酮酸脫氫酶的催化下形成BCacyl CoA（支鏈酰基輔酶A），通過琥珀酰輔酶A參與TCA循環，影響機體的能量代謝[22]（圖6）。本實驗中，支鏈氨基酸含量下降，可能在艾灸過程中有更多的支鏈氨基酸作為底物形成生酮參與到TCA循環中，調節組織能量代謝。此外，BCKDH表達減少與體重和肥胖呈顯著負相關[21]。艾灸胃經后支鏈氨基酸，乳酸含量降低揭示艾灸可能促進胃組織細胞有氧氧化，相對減少無氧糖酵解而提高機體能量代謝。

圖6 BCAA及其分解代謝酶與營養物質及代謝途徑的相互作用

谷氨酰胺是人體中含量比較多的氨基酸，它是神經系統中谷氨酸類神經遞質的前體[23,24]，可增加腸道血流量和耗氧量，對維持胃腸黏膜的完整性發揮重要的作用[25]。研究發現，在正常和缺氧條件下，谷氨酰胺驅動的氧化磷酸化是轉化為哺乳動物ATP的主要來源[26]。谷氨酰胺可用于生產煙酰胺、腺苷磷酸、核苷酸、嘌呤、抗氧化劑以及維持細胞的完整性。機體在營養不良、體育鍛煉恢復等分解代謝條件下，利用谷氨酰胺的比率高于或等于葡萄糖的比率[27,28]。人體內谷氨酰胺通過激活細胞外信號激酶和C-Jun末端激酶來調控免疫細胞的增殖[29]，如白細胞利用谷氨酰胺作為能量底物，參與組織的修復過程[30]。在中性粒細胞中，谷氨酰胺對于避免中性粒細胞中NADPH（還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷）氧化酶活性的改變和腎上腺素引起的過氧化物酶的產生具有重要意義[31]。谷氨酰胺代謝過程中產生的TCA循環代謝物，如檸檬酸、琥珀酸、富馬酸等，在適應性和先天性免疫中參與炎癥控制和內在免疫反應[30]。研究發現，以自然殺傷細胞系（NK-92）為培養對象，加入一定濃度谷氨酰胺后，培養一段時間后，谷氨酰胺濃度顯著下降，NK-92顯著擴增且促進胞內ATP生成[32]。艾灸足三里4周后，谷氨酰胺含量下降，可能是谷氨酰胺作為底物，通過谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路參與到TCA循環中，為機體ATP合成和消耗及提升機體免疫提供物質基礎。

2-花生四烯酸甘油磷酸膽堿是甘油磷酸膽堿家族成員，甘油磷酸膽堿（GPC）是卵磷脂分解而來[33]，由磷酰基、甘油和膽堿組成[34,35]，它不僅是磷脂代謝的中間產物，而且是合成磷脂酰膽堿和乙酰膽堿的前體物質。研究發現，當機體使用儲存的脂肪作為能量來源時，甘油會被釋放到血液中，然后轉化葡萄糖，為細胞的新陳代謝提供能量[36]。膽堿是一種重要的營養物質，有助于維持細胞膜結構的完整性、甲基代謝、跨膜信號、脂-膽固醇運輸和代謝以及正常大腦的發育[37]。研究發現，GPC攝入有助于衰老相關的現象（味覺敏感性和能量調節），同時對脂質代謝產生積極的影響[38]。本實驗研究，艾灸足三里可增加2-花生四烯酸甘油磷酸膽堿含量，提示艾灸足三里調節能量代謝和發揮其延緩衰老作用可能與脂質代謝相關。

熱性中藥干姜主要通過視黃醇代謝、脂質代謝和嘌呤代謝通路影響胃的能量代謝。影響視黃醇代謝的差異代謝物為視黃酯，其在一定條件下可分解為視黃醇和視黃酸。研究發現，視黃醇（維生素A）是激活線粒體蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）的重要輔助因子[39]，結合位點定位于Raf和蛋白激酶C家族的調控域，特別是鋅指結構域，也包含他們的激活中心，其通過氧化還原作用激活PKC，蛋白激酶被激活后一方面通過增加乙酰輔酶A（acetyl-CoA）的產量，進而刺激PDH（丙酮酸脫氫酶）復合物[40-41]，增加丙酮酸的利用率[42]，從而促進線粒體內氧化磷酸化，導致線粒體耗氧量和ATP合成增加；另一方面維生素A線粒體中其電子載體的作用，與PKC（蛋白激酶）結合后可以加快電子的傳遞，進而促進氧化磷酸化進程。在本實驗中，視黃酯含量下降，推測視黃酯可能通過自身消耗，促進線粒體氧化磷酸化過程。影響脂質代謝的差異代謝物花生四烯酸。花生四烯酸可通過PKC/AMPK信號傳導激活脂肪細胞，降低脂肪水平。影響嘌呤代謝的差異代謝物是黃嘌呤。黃嘌呤是黃嘌呤氧化酶氧化次黃嘌呤的產物之一。體內90%的次黃嘌呤可以通過修復作用再利用形成次黃嘌呤核苷酸。嘌呤核苷酸循環可通過提高AMP（一磷酸腺苷）活性、脫氨和參與三羧酸循環來調節能量代謝[43]。實驗發現黃嘌呤含量下降，推測可能次黃嘌呤通調節TCA循環來影響能量代謝。

本研究發現，體外艾灸 “足三里” 和口服熱性中藥干姜均可影響胃組織的能量代謝。艾灸可提高正常大鼠的能量代謝相關因子的活性，體現了艾灸的溫熱特性及補陽特點。其影響這些特性的機制主要是通過調節氨基酸代謝，脂質代謝，其中氨基酸代謝主要是通過相關的物質生成生酮，進而參與到三羧酸循環中去，從而影響能量的代謝。熱性中藥干姜主要通過視黃醇代謝、脂質代謝、嘌呤代謝調節能量代謝。