琥珀蠶孵化酶基因AaHE的克隆及啟動子活性分析

陳安利, 董占鵬, 唐順明, 劉增虎, 李 濤, 廖鵬飛, 李瓊艷,*

(1. 云南省農業科學院蠶桑蜜蜂研究所, 云南蒙自 661101; 2. 安康學院陜西省蠶桑重點實驗室, 陜西安康 725000;3. 江蘇科技大學生物技術學院, 江蘇鎮江 212003)

大多數昆蟲在胚胎發育完成后，利用特殊的破卵構造，如刺、骨化板、能翻縮的囊等破壞卵殼后孵化而出，這類構造常被稱為破卵器。一般半翅目(Hemiptera)、脈翅目(Neuroptera)和虱目(Anoplura)昆蟲在孵化前不久，胚胎外面產生一層暫時性的表皮質被膜，包裹著整個蟲體，破卵器就發生在這層被膜上。沒有這種被膜的昆蟲，如雙翅目(Diptera)的線角類、蚤目(Siphonaptera)和鞘翅目(Coleoptera)的葉甲等，它們的破卵器直接發生在幼蟲的表皮上，特別是頭部，一直保留到第一次蛻皮前(彩萬志等, 2001)。鱗翅目(Lepidoptera)昆蟲與以上昆蟲存在較大差異，大多以上顎直接咬破卵殼，在此過程中孵化酶(hatching enzyme, HE)發揮了重要的作用。

1937年，Slifer研究發現蝗蟲卵孵化時需要一種幾丁質酶參與降解蝗蟲卵白殼區域(Slifer, 1937)，這是有資料可查的最早的關于昆蟲卵孵化的分子生物學的研究。直到1999年，澳大利亞科學家Bowles課題組對寄生綿羊銅綠蠅Luciliacuprina卵的孵化相關的蛋白酶進行了探索研究，認為絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶參與了其孵化過程；2007年該課題組對人類害蟲虱子卵孵化過程研究發現金屬蛋白酶扮演了重要角色(Youngetal., 2000; Bowlesetal., 2008)。孵化酶在絹絲鱗翅目昆蟲卵孵化過程中同樣發揮了重要作用，在幼蟲咬破卵殼之前，孵化酶先軟化卵殼，以保護蟻蠶脆嫩的口器。唐順明小組先后對絹絲鱗翅目昆蟲家蠶Bombyxmori(Luetal., 2010; 唐順明等, 2010; Tangetal., 2012)、野桑蠶Bombyxmandarina(唐順明等, 2011)、柞蠶Antheraeapernyi(唐順明等, 2011)和桑樹主要害蟲之一桑蟥Rondotiamenciana(王煥英, 2014)的卵孵化分子機理進行了較為系統地研究，克隆獲得的孵化酶基因編碼的氨基酸序列具有孵化酶特有的功能域，在進化上比較保守。該基因在體外表達系統表達獲得的蛋白對家蠶卵殼底物有一定的活性(唐順明等, 2010)，孵化酶的酶學特征調查表明，一些金屬螯合劑對其有較強的抑制作用，同時以孵化酶基因為靶點，利用RNAi技術有效抑制了蠶卵的孵化。

琥珀蠶Antheraeaassama屬鱗翅目大蠶蛾科(Saturniidae)柞蠶屬Antheraea的絹絲昆蟲(Arunkumaretal., 2012; Singhetal., 2012)，琥珀蠶絲與桑蠶絲相比，具有更好的強伸力、更強的吸濕性、呈金黃色金屬光澤且不易褪色，經濟利用價值較高(Freddietal., 1994; Ahmadetal., 2004; Unnietal., 2008)。云南省農業科學院蠶桑蜜蜂研究所于2010年在云南地區收集到琥珀蠶，經過幾年的探索，成功實現了琥珀蠶的室內飼養。但由于琥珀蠶馴化程度不高，蠶卵孵化不齊，成為制約琥珀蠶大規模室內飼養的關鍵因素。本研究以琥珀蠶為研究對象，克隆獲得琥珀蠶卵孵化酶基因cDNA全長和啟動子序列，并分析其序列組成、表達特征和啟動子活性，為選擇合適的抑制劑或促進劑調節琥珀蠶卵的孵化率提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試琥珀蠶由云南省農業科學院蠶桑蜜蜂研究所于2010年從野外收集并馴養保存。蠶卵在室溫下催青孵化，幼蟲置于室內用天竺桂Cinnamomumpedunculatum新鮮葉片飼養，自然溫度和光照，相對濕度在75%～80%之間。取5齡第3和4天幼蟲的絲腺、馬氏管、頭、中腸、脂肪體、表皮、血液、精巢和卵巢組織，同時從母蛾產下受精卵開始每天收集卵，置于液氮中速凍后，于-80℃保存備用。

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

取1.1節中的各組織(每個組織為2頭蠶的混合物，3次生物學重復)和卵(多個母蛾同一天產下的卵混收，每天取30粒卵，分3組，每組10粒卵)加液氮研磨成粉末，加入1 mL TRIzol (Life Technologies公司)，按照RNA提取操作手冊提取總RNA。提取的總RNA經瓊脂糖凝膠電泳檢測質量，并用BIOMATE 3S微量分光光度計(Thermo)測定濃度后取各組織的500 ng總RNA，用反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)合成cDNA，cDNA用BIOMATE 3S微量分光光度計檢測其濃度和質量，稀釋5倍后于-20℃保存備用。

1.3 目的基因全長cDNA的克隆和生物信息學分析

參照鱗翅目昆蟲孵化酶基因的保守序列HEWMHILGFLHMHATYNR和Met-轉角基序SCLHY，合成簡并引物(F: 5′-GCCSAACRACACCG TYGTYTGGGA-3′; R: 5′-ACWCCYTCGTGYTCCYK CAGAGC-3′)，以琥珀蠶中腸cDNA為模板PCR擴增目的基因CDS的部分序列。PCR體系: ddH2O 13.8 μL, 10×Ex Taq Buffer (20 mmol/L Mg2+plus) 2 μL, dNTP Mixture (各2.5 mmol/L) 1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL, TaKaRa Ex Taq (5 U/μL) 0.2 μL。PCR擴增程序: 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 1 min, 共33個循環；72℃延伸10 min。擴增產物委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。以測序鑒定后的序列為參考，設計目的基因5′-RACE和3′-RACE特異性引物(表1)。

以琥珀蠶中腸總RNA為模板，參照SMARTer? RACE 5′/3′ Kit (TaKaRa)說明書反轉錄獲得cDNA。以合成的cDNA第1鏈為模板，用含有部分接頭序列的通用引物UPM (表1)為上游引物，以目的基因的5′-RACE特異性引物為下游引物，PCR擴增獲得目的基因cDNA的5′末端序列。以合成的cDNA第1鏈為模板，用目的基因的3′-RACE特異引物為上游引物，以含有部分接頭序列的通用引物UPM為下游引物，PCR擴增獲得目的基因cDNA的3′末端序列。PCR產物克隆進pMD19-T載體(TaKaRa)中，轉化大腸桿菌EscherichiacoliTOP10感受態細胞，用含氨芐青霉素(Amp)的LB平板篩選陽性克隆。用M13引物(表1)進行菌液PCR鑒定重組質粒，鑒定后的質粒委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序正確的序列拼接后獲得目的基因完整的cDNA序列。

利用Compute pI/Mw Tool (http:∥web.expasy.org/compute_pi/)預測目的基因編碼的蛋白質的分子質量與等電點；采用SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)預測蛋白的信號肽和結構域；目的蛋白的氨基酸序列在NCBI中進行Blast。選擇Blast結果中的前25個序列，用MEGA 6.0 軟件(Tamuraetal., 2013)的最大似然(maximum likelihood)法構建系統進化樹，重復運行1 000次判斷是否屬于直系同源序列。

1.4 qRT-PCR檢測目的基因的表達

參照目的基因的CDS序列，設計qRT-PCR引物SYBR-F/SYBR-R(表1)。以1.2節中各組織和不同發育時期的卵的cDNA為模板，以β-actin(表1)為內參基因(陳安利等, 2018)，在熒光定量PCR儀StepOnePlus Realtime PCR System (Applied Biosystems)上進行PCR反應，每個反應設置3次生物學重復(每個重復的幼蟲各組織來自2頭蟲體、不同發育時期的卵10粒)。反應體系: 2×SYBR Premix ExTaq(Roche) 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL, cDNA模板1 μL, ddH2O 7.4 μL。PCR擴增程序: 95℃ 1 min; 95℃ 30 s, 58℃ 1 min, 共40個循環。通過2-ΔΔCt計算目的基因在各個組織中的相對表達量。

1.5 目的基因啟動子序列的克隆

以琥珀蠶5齡第4天幼蟲的中腸組織為材料，參照動物基因組DNA快速抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]的說明書提取基因組DNA。以1.3節獲得的目的基因CDS序列為參考設計引物CDS-F/CDS-R (表1)，以基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲取第一內含子序列。PCR體系: ddH2O 13.3 μL, 10×Ex Taq Buffer (20 mmol/L Mg2+plus) 2 μL, dNTP Mixture (各2.5 mmol/L) 1.5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL, TaKaRa Ex Taq (5 U/μL) 0.2 μL。PCR擴增程序: 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 80 s, 共33個循環；72℃延伸10 min。以第1外顯子和第1內含子序列為參考設計3條同向且退火溫度較高的特異性引物SP1, SP2和SP3(表1)，參照Genome Walking Kit (TaKaRa)說明書，與試劑盒中提供的4種經過特別設計的退火溫度較低的簡并引物AP1, AP2, AP3和AP4進行熱不對稱PCR反應，通過3次巢式PCR反應獲取上述已獲得序列的側翼序列。使用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 4.0 (TaKaRa)切膠回收擴增產物條帶。用SP3引物對PCR純化產物進行測序，鑒定純化產物與上述已獲得序列的同源性。使用DNA Ligation Kit (TaKaRa)將與上述已獲得序列有同源性的純化產物與pMD19-T連接，熱轉化至大腸桿菌感受態細胞 (TaKaRa)中，涂布平板37℃過夜培養。挑選陽性菌落植菌后提取質粒，使用M13F, M13R, P1和P2引物對質粒進行測序。以測序結果兩端的序列為參考，設計引物，以基因組DNA為模板進行PCR擴增，鑒定測序結果的準確性。用啟動子在線分析軟件(https:∥www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)分析獲得的側翼序列，預測啟動子的核心區。設計特異性引物-727～-1F/-727～-1R (表1)擴增5′-UTR上游包含啟動子核心區的序列。

1.6 目的基因啟動子的活性檢測

用SalⅠ和HindⅢ對1.5節中啟動子擴增序列和pIZ-EGFP載體進行雙酶切，將啟動子擴增產物連接到昆蟲細胞表達載體pIZ-EGFP的EGFP基因上游，替換pIZ-EGFP載體上的OpIE-2啟動子序列，構建昆蟲細胞重組表達載體。對pIZ-EGFP載體酶切位點分析時發現，在切除OpIE-2啟動子序列的同時，也切除了OpIE-2啟動子上游的SV40 poly (A) signal序列。為了排除SV40 poly (A) signal序列的切除對基因表達的影響，我們設計了一對引物PIZ-F/PIZ-R (表1)，以pIZ-EGFP載體序列為模板，擴增了SV40 poly (A) signal序列。擴增獲得的SV40 poly (A) signal序列與啟動子擴增序列一起通過無縫克隆構建了重組昆蟲細胞表達載體pIZ-AaHE-EGFP。無縫克隆參照In-Fusion? HD Cloning Kit試劑盒(TaKaRa)的說明書進行。構建后的重組表達載體轉化大腸桿菌TOP10感受態細胞，用博來霉素(zeocin)的LB平板篩選陽性克隆。挑選陽性菌落植菌后提取質粒，質粒(1 μg)經脂質體介導轉染家蠶卵巢細胞株BmN，72 h后將細胞置于倒置熒光顯微鏡下觀察。脂質體介導參照Cellfectin Reagent試劑盒(Invitrogen)說明書進行。通過觀察轉染后綠色熒光蛋白EGFP的表達情況，確定獲得的啟動子序列是否具有活性。

2 結果

2.1 琥珀蠶孵化酶基因的cDNA全長

PCR擴增獲得一條長度為516 bp的目的片段。去除兩端簡并引物后，最終獲得的序列片段大小為469 bp。以獲得的序列為參考設計目的基因的特異性RACE引物，與通用接頭引物UPM一起進行PCR擴增，獲得目的基因5′和3′末端的cDNA序列。利用BioEdit軟件對測序片段進行拼接，獲得目的基因的全長cDNA序列，長993 bp(GenBank登錄號: KT336227.1)，其中5′UTR長15 bp，3′UTR長65 bp，poly(A)尾巴長28 bp，CDS長885 bp，編碼294個氨基酸(圖1)。3′UTR含有典型的低G+C區域，并在距離poly(A)尾巴上游的13 bp處有典型的多聚腺苷酸化信號(圖1)。

2.2 琥珀蠶孵化酶的氨基酸序列特征

目的蛋白的分子質量為33.7 kD，理論等電點為5.17，含有1個信號肽(1-16 aa)和1個ZnMc結構域(92-242 aa)，ZnMc結構域內含有1個HExxH鋅結合位點(圖1)。將目的基因編碼的氨基酸序列在NCBI中進行Blast分析，結果顯示目的蛋白的氨基酸序列與柞蠶Antheraeapernyi類孵化酶蛋白(hatching enzyme like) ApHEL的氨基酸序列一致性最高，達到93.17%，其次是樗蠶Samiacynthiacynthia孵化酶蛋白SccHE，氨基酸序列一致性為89.80%，這與柞蠶、樗蠶和琥珀蠶同為大蠶蛾科絹絲昆蟲相符。系統進化樹結果顯示，目的蛋白與蛾類親緣關系明顯高于與蝶類的(圖2)，這與琥珀蠶為大蠶蛾科昆蟲相符，另外與目的蛋白親緣關系最近的9個蛋白中有8個為孵化酶蛋白(圖2)，因此將其命名為琥珀蠶孵化酶蛋白AaHE(GenBank登錄號: AKS39779.1)。

圖2 最大似然法構建的基于氨基酸序列的琥珀蠶AaHE和其他同源蛋白的系統進化樹

2.3 AaHE的表達譜

qRT-PCR檢測結果顯示，AaHE在琥珀蠶5齡第4天幼蟲的中腸組織中表達量明顯高于其他組織(圖3)，這可能與該基因參與調控中腸組織的消化吸收有關(Rawlings and Barrett, 1995)。另外，在胚胎發育過程中，AaHE表達量在胚胎發育前中期維持在很低的水平，在胚胎發育后期特別是卵孵化前(卵產下后第9天)，AaHE基因的表達量迅速升高(圖4)，這可能與孵化過程中需要大量的孵化酶軟化卵殼有關。

圖3 AaHE在琥珀蠶5齡幼蟲各組織中的相對表達量

圖4 AaHE在琥珀蠶胚胎不同發育階段的相對表達量

2.4 AaHE基因啟動子

克隆獲得了大小為1 419 bp的第1內含子序列，以此為參考進行染色體步移，最終獲得5′UTR上游共2 792 bp的序列(圖5)。用在線啟動子分析軟件(https:∥www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)對獲得的2 792 bp序列進行分析，預測了兩個啟動子核心區(5′UTR的起始堿基記作+1，與之相鄰的側翼序列堿基記作-1；核心區1：-727～-477 bp；核心區2：-2 337～-2 086 bp)，兩個核心區均存在啟動子的核心序列TATA盒和其共有序列TATAAAA(圖5)。根據預測的核心區的位置，我們選擇距離起始密碼子較近的核心區1作進一步分析。核心區1內存在8個轉錄因子結合位點，其中6個為基礎轉錄因子TFIID的結合位點，1個為轉錄因子EivF/CREB結合位點，1個為轉錄因子CP1結合位點。

2.5 AaHE基因啟動子的活性

重組昆蟲細胞表達載體pIZ-AaHE-EGFP經脂質體介導轉染家蠶卵巢細胞株BmN，72 h后，將細胞置于倒置熒光顯微鏡下可以觀察到明顯的綠色熒光(圖6)，說明AaHE5′UTR上游-727～-1的序列具有啟動子活性，能夠啟動EGFP基因的表達。

3 討論

本研究對琥珀蠶孵化酶基因AaHE的cDNA序列分析表明，AaHE是一種含有HExxH鋅結合基序的鋅依賴性金屬蛋白酶基因，與柞蠶、家蠶、野蠶的孵化酶基因屬于同一類，該類蛋白酶既是肽酶，同時又是一種消化酶(Rawlings and Barrett, 1995)。琥珀蠶卵殼相較于家蠶，硬度更高，卵殼不經過軟化，幼蟲無法直接咬破卵殼。AaHE在琥珀蠶卵孵化過程中特異性高表達，可能是利用其裂解肽作用軟化卵殼，起到保護幼蟲口器的作用，而AaHE在中腸中特異性高表達(圖3)，可能與其具有的消化酶屬性有關。研究者(唐順明等, 2010)對柞蠶孵化酶的酶學特征調查表明，一些金屬螯合劑對其有較強的抑制作用，而琥珀蠶孵化酶蛋白AaHE與柞蠶、蓖麻蠶Philosamiacynthiaricini、家蠶等孵化酶蛋白相似，均含有ZnMc結構域，通過分析琥珀蠶孵化酶蛋白的氨基酸序列，可為下一步選擇合適的抑制劑或促進劑調節琥珀蠶卵的孵化率提供幫助。

本研究對AaHE基因啟動子核心區的序列分析顯示，核心區存在8個轉錄因子結合位點，其中6個為基礎轉錄因子TFIID的結合位點，1個為轉錄因子EivF/CREB結合位點，1個為轉錄因子CP1結合位點(圖5)。TFIID是寡聚蛋白，由TATA結合蛋白(TATA binding protein, TBP)和13個TBP相關因子(TBP associated factors, TAFs)組成(Goodrich and Tjian, 2010; Mulleretal., 2010)。當TFIID與啟動子結合后，TAFs可以與轉錄激活因子、共激活因子、染色質修飾因子、轉錄延伸因子等發生相互作用，使TFIID接受來自不同方面的調控信號，從而調控基因的表達(Aaslandetal., 1995; Bell and Tora, 1999; Garbettetal., 2007; Lauberthetal., 2013)。研究表明，TFIID在配子發生和早期胚胎發育過程中發揮了重要作用(郝國禮和于海泉, 2014)，但其是否會影響昆蟲卵的孵化，目前尚未見報道。轉錄因子EivF和CREB具有相同的識別位點，二者均是從HeLa細胞中分離而來，通過結合腺病毒早期III區(EIII)和早期IV區(EIV)啟動子中的CRE(cAMP response element)促進轉錄(Cortesetal., 1988)。EivF與腺病毒EIV啟動子特異性結合，CREB能夠與腺病毒EIV啟動子中的CRE以及腺病毒EIII啟動子中的兩個DNA元件(ATF和AP1)結合(Merinoetal., 1989; Mirallesetal., 1989)，兩者之間的相互作用關系目前還不清楚。轉錄因子CP1的報道較少，研究表明CP1對釀酒酵母甲硫氨酸生物合成 (methionine biosynthesis, MET)基因的轉錄起到促進作用(O'Connelletal., 1995)。本研究為進一步采用凝膠電泳阻滯法確定特異性結合的轉錄因子或蛋白，通過調控特異性轉錄因子的表達進而達到調節AaHE表達的目的提供了參考。