Smad7通過PI3K/Akt/mTOR信號通路調控人腦膠質瘤U-87MG細胞的生物學性狀

謝云鵬,胡 軍,柳 新,劉 兵,于 淼,呼鐵民*

(1承德醫學院附屬醫院神經外科,承德 067000;2承德醫學院附屬醫院腫瘤科;*通訊作者,E-mail:cyfysjwk1@163.com)

腦膠質瘤是中樞神經系統最為常見、發病率最高且預后最差的原發性腫瘤之一[1]。臨床上治療手段依然是手術聯合放化療為主,切除不徹底和放化療藥物不易通過血腦屏障成為腦膠質瘤治療的巨大瓶頸。近年來研究發現,腦膠質瘤的發生發展是多因素、多基因共同參與的結果[2],探究腦膠質瘤發生及發展的分子機制、尋找新的生物治療靶點已迫在眉睫。Smad7是轉化生長因子β(TGF-β)受體激酶底物[3],是Smads家族中3個亞型中的抑制型Smad,Smad7最主要的作用是作為TGF-β信號通路的負調控因子[4]。有研究表明,Smad7還能以不依賴TGF-β1的方式去影響一些參與致癌過程調控的分子的表達和功能[5]。本研究以腦膠質瘤細胞系U-87MG為研究對象,獨立于TGF-β信號通路探討Smad7對腦膠質瘤細胞增殖與凋亡影響的作用機制,為腦膠質瘤的生物靶向治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人腦星形膠質母細胞瘤U-87MG細胞(賽百慷上海生物公司)。Smad7 siRNA及轉染試劑lipofectamine2000(lipo2000)均為美國Invitroden公司產品。PCR引物由上海生物工程有限公司合成,Trizol總RNA抽提試劑盒、第1鏈cDNA合成試劑盒及PCR擴增試劑盒均購自寶生物工程大連有限公司。Smad7、PCNA、CyclinD1、Bcl-2、Bax、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR及β-actin鼠源單克隆抗體均購于美國Epitomics公司,羊抗鼠二抗購于美國KPL公司。CCK-8購于美國APExBIO公司。細胞凋亡試劑盒購于美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染 腦膠質瘤U-87MG細胞于含10%胎牛血清的1640培養基中,置于5%二氧化碳的37 ℃細胞培養箱中培養。將細胞分為干擾組(Smad7-si)轉染靶向Smad7的siRNA,陰性對照組轉染陰性對照siRNA,空白對照組不做任何處理。轉染前24 h取對數生長期的U-87MG細胞接種于6孔板中,每孔細胞1×105個,完全培養基2 ml,要求細胞在24 h達到45%-70%融合。按照lipo2000說明書推薦最佳比例,每孔siRNA用量為7.5 μl,lipo2000為5 μl,均用無血清培養基稀釋,混合后室溫靜置20 min,將混合物柔和加入6孔板中。輕搖混勻,置于培養箱中培養6 h后更換為完全培養基繼續培養,于48 h收集細胞進行后續相關檢測。

1.2.2 Western blot檢測各組Smad7蛋白的表達 收集各組U-87MG細胞,每孔加入80 μl細胞裂解液,提取總蛋白,BCA蛋白定量試劑盒檢測總蛋白濃度,與樣品處理液按比例混合后100 ℃處理10 min,每孔加樣30 μg,80 V穩壓電泳,轉膜,脫脂奶粉室溫封閉2 h,Smad7單抗(1 ∶1 000)室溫孵育2 h,TBST洗膜,二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h,TBST洗膜,ECL超敏發光,于化學發光儀顯影并保存條帶。Quantity One 4.6.2軟件計算條帶灰度值,計算Smad7/β-actin數值,即Smad7的相對表達量。

1.2.3 細胞計數并繪制細胞生長曲線檢測各組細胞的增殖 轉染6 h用胰酶將細胞消化成細胞懸液,按5×103個/孔的密度接種于96孔板,分別在轉染24,48,72 h對各組細胞進行計數,每組取3孔,每孔計數3次,求平均值,繪制細胞增殖曲線。

1.2.4 CCK-8實驗檢測各組細胞增殖 轉染6 h用胰酶將細胞消化成細胞懸液,按5×103個/孔的密度接種于96孔板,每組6個孔,每孔100 μl,在轉染48 h每孔加入10 μl CCK-8溶液,將培養板在培養箱中孵育2 h,用酶標儀測定450 nm處的吸光度值。

1.2.5 克隆形成實驗檢測各組細胞增殖 將細胞(5×102/孔)接種于12孔板中,置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中,37 ℃,5% CO2培養14 d。然后用4%多聚甲醛固定20 min,再用0.1%結晶紫染色20 min,計數含有≥20個細胞的菌落數,獲得具有代表性的圖像。

1.2.6 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率 用不含EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化轉染48 h的細胞,制成單細胞懸液,通過細胞計數保證每組細胞數量為5×105個,用PBS洗滌細胞2次,離心重懸細胞,每組加入500 μl結合緩沖液,加入Annexin Ⅴ-FITC和PI各5 μl,柔和混勻,室溫避光5 min,流式細胞儀上機檢測。

1.2.7 Western blot檢測各組細胞增殖、凋亡及通路相關蛋白表達情況 收集各組U-87MG細胞,每孔加入80 μl細胞裂解液,提取總蛋白,BCA蛋白定量試劑盒檢測總蛋白濃度,與樣品處理液按比例混合后100 ℃處理10 min,每孔加樣30 μg,80 V穩壓電泳,轉膜,脫脂奶粉室溫封閉2 h,PCNA、CyclinD1、Bcl-2、Bax、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR單抗(1 ∶1 000)室溫孵育2 h,TBST洗膜,二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h,TBST洗膜,ECL超敏發光,于化學發光儀顯影并保存條帶。Quantity One 4.6.2軟件計算條帶灰度值,計算目的蛋白/β-actin數值,即目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 靶向Smad7的siRNA抑制效率鑒定

與陰性對照組相比,干擾組Smad7蛋白的表達顯著降低(P<0.05);陰性對照組與空白對照組相比,差異無統計學意義(P>0.05,見圖1)。

與陰性對照組比較,*P<0.05圖1 Western blot檢測Smad7的表達Figure 1 Expression of Smad7 by Western blot

2.2 敲低Smad7對各組細胞生長的影響

細胞生長曲線結果顯示,與陰性對照組相比,干擾組細胞的增殖速度明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.05)。而陰性對照組與空白對照組間差異無統計學意義(P>0.05,見圖2)。

與陰性對照組比較,*P<0.05圖2 敲低對各組細胞生長的影響Figure 2 Effect of Smad7 knockdown on cell proliferation

2.3 敲低Smad7對各組細胞增殖活力的影響

通過CCK-8實驗,分別記錄轉染48 h各組細胞的吸光度值,結果顯示,干擾組吸光度值明顯高于陰性對照組,差異具有統計學意義(P<0.05)。而陰性對照組與空白對照組間差異無統計學意義(P>0.05,見圖3)。

與陰性對照組比較,*P<0.05圖3 CCK-8實驗檢測各組細胞增殖活力Figure 3 Cell proliferation activity in each group by CCK-8 assay

2.4 敲低Smad7對各組細胞克隆形成能力的影響

克隆形成實驗顯示,干擾組克隆形成數明顯高于陰性對照組,差異具有統計學意義(P<0.05)。而陰性對照組與空白對照組間差異無統計學意義(P>0.05,見圖4,5)。

圖4 克隆形成實驗檢測各組細胞克隆形成數Figure 4 Numbers of cell clone by clonal formation assay

與陰性對照組比較,*P<0.05圖5 敲低Smad7對各組細胞克隆形成能力的影響Figure 5 Effect of Smad7 knockdown on cell clone formation in each group

2.5 敲低Smad7對各組細胞增殖相關蛋白PCNA、CyclinD1表達的影響

Western blot結果顯示,干擾組細胞增殖相關指標PCNA和CyclinD1蛋白表達水平較其他兩組均升高(P<0.05),而陰性對照組與空白對照組的差異無統計學意義(P>0.05,見圖6)。

與陰性對照組比較,*P<0.05圖6 Western blot檢測敲低Smad7對PCNA和CyclinD1表達的影響Figure 6 Effect of Smad7 knockdown on expression of PCNA and CyclinD1 proteins by Western blot

2.6 敲低Smad7對各組細胞凋亡的影響

流式細胞實驗結果顯示,干擾組凋亡率低于陰性對照組和空白對照組(6.41%±0.45%,vs12.34%±0.47%,12.58%±0.28%,P<0.05),陰性對照組和空白對照組間差異無統計學意義(P>0.05,見圖7)。

與陰性對照組比較,*P<0.05圖7 流式細胞術檢測敲低Smad7對細胞凋亡率的影響Figure 7 Effect of Smad7 knockdown on apoptotic rate of cells in each group by flow cytometry

2.7 敲低Smad7對各組細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax表達的影響

Western blot結果顯示,細胞凋亡相關指標Bcl-2蛋白表達水平變化不大,但Bax蛋白表達水平較其他兩組均降低(P<0.05),而陰性對照組與空白對照組間差異無統計學意義(P>0.05,見圖8)。

與陰性對照組比較,*P<0.05圖8 Western blot檢測敲低Smad7對各組細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax表達的影響Figure 8 Effect of Smad7 knockdown on expression of Bcl-2 and Bax by Western blot

2.8 敲低Smad7對各組細胞PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白表達的影響

Western blot結果顯示,通路相關蛋白PI3K、Akt和mTOR的磷酸化表達水平較兩個對照組均升高(P<0.05),而陰性對照組與空白對照組的差異無統計學意義(P>0.05,見圖9)。

與陰性對照組比較,*P<0.05,**P<0.05圖9 Western blot檢測敲低Smad7對各組細胞PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白表達的影響Figure 9 Effect of Smad7 knockdown on expression of PI3K/Akt/mTOR-related proteins by Western blot

3 討論

腦膠質瘤是臨床最為常見的顱內腫瘤,生存期短、復發率和病死率高[6]。惡性增殖及侵襲性生長是其主要特征[7]。近年來研究顯示,腦膠質瘤發病率逐年上升,約占中樞神經系統的50%[8],腦膠質瘤的傳統療法即手術切除輔助放化療并不能有效延長患者的總生存期[9],因此,尋找腦膠質瘤生物治療的有效靶點顯得尤為必要。

Smad7最廣為人知的功能是與TβR1結合,并與Smad2/3競爭磷酸化的催化位點,從而阻止Smad2/3的磷酸化[10],除此之外,Smad7還可以通過招募磷酸酶來促進TβR1的脫磷酸化即失活[11],但關于Smad7在腫瘤中獨立于TGF-β通路而發揮作用,在腦膠質瘤相關研究中未有報道。有研究表明,Smad7在腦膠質瘤組織中有異常的高表達[12],這是否提示我們Smad7很可能是腦膠質瘤發生發展過程中的一個重要靶標呢?本研究在腦膠質瘤U-87MG細胞中敲低了Smad7的表達,通過細胞生長曲線、CCK-8實驗及克隆形成實驗發現細胞的增殖能力增強,我們又進一步采用Western blot從蛋白水平檢測了PCNA和CyclinD1的表達,PCNA是反映細胞增殖狀態的黃金指標,在細胞增殖的啟動上起重要作用[13],而CyclinD1是細胞周期G1期和S期的轉換開關,其增高可通過影響細胞周期而促進細胞的惡性增殖[14]。本研究發現,干擾組PCNA和CyclinD1均出現顯著升高,該結果進一步說明敲低Smad7會促進腦膠質瘤U-87MG細胞的增殖。

本研究通過流式細胞術檢測發現干擾組細胞凋亡率顯著下降,這說明干擾組抑制了細胞凋亡。我們又檢測了Bcl-2家族蛋白Bcl-2和Bax。Bcl-2家族基因分為促凋亡和抗凋亡基因兩類。其中Bax為促細胞凋亡的基因,Bcl-2為抗細胞凋亡基因。當該家族中促凋亡和抗凋亡基因表達平衡遭到破壞時,則影響細胞的凋亡程度[15]。本研究發現,干擾組Bax表達下降,而Bcl-2的表達未見明顯差異,但干擾組Bax與Bcl-2的比值顯著下降,說明敲低Smad7抑制了腦膠質瘤U-87MG細胞的凋亡。

在腦膠質瘤等多種腫瘤的發生發展過程中,PI3K介導的Akt/mTOR信號通路往往被激活,對腫瘤細胞的增殖和凋亡發揮著重要的作用[16]。PI3K是一種存在于細胞質的脂質激酶,可以催化磷酯酰肌醇(PIP3)D3位的磷酸化,而PIP3是Akt質膜轉運過程中的第二信使,Akt是PI3K下游的蛋白信號分子,是高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,其與PIP3相互作用后,絲氨酸/蘇氨酸位點發生磷酸化,Akt則被完全激活[17],激活的磷酸化Akt通過將mTOR的Ser-448位點磷酸化而激活mTOR,mTOR屬于PI3K蛋白激酶類家族,是p-Akt的直接底物,也是PI3K信號通路下游分子之一,被激活的mTOR具有調節細胞生長、促進細胞增殖、抑制凋亡的功能,在腫瘤的發生發展過程中發揮著重要的作用。p-Akt和p-mTOR是激活PI3K/Akt/mTOR信號通路的關鍵分子。研究表明,PI3K介導的Akt/mTOR信號通路的激活可以通過影響Bcl-2家族來抑制細胞凋亡,進而促進細胞增殖[18]。本研究發現,敲低Smad7之后,干擾組腦膠質瘤細胞PI3K、Akt、mTOR蛋白的磷酸化水平升高,即敲低Smad7反而使PI3K/Akt/mTOR信號通路更加活躍。因此我們推測,敲低Smad7對腦膠質瘤的增殖促進作用和凋亡抑制作用均與激活PI3K/Akt/mTOR信號通路有關。有研究表明,抑癌基因通過對PI3K/Akt/mTOR信號通路進行負性調節而起到抑制腫瘤細胞增殖和促進其凋亡的作用[19],因此,Smad7很可能在腦膠質瘤的發生發展過程中扮演抑癌基因的角色。

綜上,敲低Smad7可通過活化PI3K/Akt/mTOR信號通路而促進腦膠質瘤U-87MG細胞的增殖并抑制其凋亡,本研究為Smad7作為腦膠質瘤生物治療的潛在靶點提供了一定的理論依據。