顯微鏡輔助下精準切除術在裸鼠非局部晚期結腸癌中的應用

文 丹,楊宇慎,汪 準,趙雪峰

(1大連大學附屬新華醫院普外科,大連 116021;2大連大學附屬新華醫院肛腸三科;*通訊作者,E-mail:zoserbong@163.com)

結直腸癌(colorectal cancer, CRC)是一種全球性的惡性疾病,每年約有140萬新發病例,其中早期CRC的發病率正在逐年上升[1]。早期CRC被定義為可完全切除,且無鄰近器官、淋巴結或遠處部位受累的疾病[2]。但有相關研究指出,約16%的局限性黏膜下浸潤性CRC可能早已存在淋巴結轉移[3],這與患者術后復發和轉移息息相關。Goodwin等[4]指出CRC患者術后3年內的復發率高達80%,其中約5%-35%的Ⅰ-Ⅲ期患者死于術后復發和轉移。因此,早期的篩查和診斷、明確的分期、精準的治療均影響著患者的預后。由于精準醫療理念的逐漸深化,針對早期惡性腫瘤的精準切除取得了一定的進展,如以前哨淋巴結活檢(SLNB)為指導的精準切除在早期乳腺癌中的成功實施,這一理念也已被應用于胃癌、直腸癌等消化道腫瘤的治療。為了進一步評估精準切除在早期結直腸癌(CRC)中的實用性,建立相應的實驗動物模型或許是一個有效的方式。

近年來,越來越多的動物模型被應用于各種惡性腫瘤的機制闡述、藥物療效評估和新藥開發等方面的研究。但是，因為實驗鼠科動物的生理解剖局限，如腸管小、腸壁薄等，行腸切除手術難度較大,所以目前對CRC的手術模型仍停留在模型建立的初級階段,且罕有報道。同時,隨著生物醫學研究的成像工具如MRI、Micro PET-CT和IVIS(invivoimage system)等的出現,實驗動物模型的真實性和可信度也備受關注。在實驗動物活體狀態下通過非侵入性手段對體內標記的細胞或分子的變化進行實時檢測和定量剖析,從而使腫瘤或疾病的發生發展過程直觀化和圖像化[5,6]。這不僅改變了過去以解剖為主要評價手段的形勢,減少了人力、物力上的消耗,還為動物模型提供了更具說服力和可信度的直觀化證據。事實上,已經有許多用熒光素酶標記的轉移性腫瘤模型被報道[7-9]。因此本文中,我們嘗試建立一種裸鼠非局部晚期結腸癌(non-local advanced colon cancer, NLACC)精準切除模型來模擬臨床早期CRC的外科治療情況,并通過組織病理學檢測和影像學分析初步評估顯微鏡輔助下區段切除術(microscopic assisted limited colectomy, MALC)對NLACC裸鼠的療效,從而驗證MALC模型的技術可行性和腫瘤學安全性。

1 材料和方法

1.1 材料

CT-26-Fluc鼠源性結直腸癌細胞由大連大學附屬新華醫院實驗中心提供;BALB/c品系裸鼠共20只,7周齡雌鼠,體質量18-20 g,由大連大學附屬新華醫院中心實驗室代為購買。SMZ-B2/T2體視顯微鏡和異氟烷吸入麻醉藥及動物麻醉系統均由大連大學附屬新華醫院中心實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 CT-26-Fluc鼠源性結直腸癌細胞接種于100 mm培養皿中,并在37 ℃、5%CO2、含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基內傳代培養。每2-3 d更換一次培養液。培養細胞密度達80%-90%,用PBS潤洗2次,經胰酶(0.25% Trypsin-0.53 mmol/L EDTA)消化后,1 500 r/min離心5 min。然后用無血清的培養基洗滌3次后再使細胞重懸。顯微鏡下計數,用無血清培養基調整細胞濃度至4×107/ml,均制備成1 ml細胞懸液。冰浴中保存,備用(30 min內完成接種)。

1.2.2 實驗動物 參與模型的實驗裸鼠共20只。所有實驗裸鼠被安置在專用鼠類塑料籠上,不超過4只/籠;并在控制溫度(21±2)°C、濕度(50±10)%和照明(12-12 h光暗循環)的條件下生長。試驗開始前均保持1周的馴化期。所有小鼠的操作和治療都是按照《實驗動物管理和使用指南》中規定的程序進行的。該實驗方案已獲得大連大學附屬新華醫院倫理委員會批準。在研究結束時,所有裸鼠在全身麻醉下處死。

1.2.3 動物模型設計 制模前1周仔細了解BALB/c裸鼠生活習性,禁止一切刺激性操作。首先,建立穩定的原發性結腸癌裸鼠模型(NALCC模型);通過1周的觀察期后,將這些模型隨機分成兩組,分別為MALC組和假手術組,每組10只;術后觀察期為3周。觀察期結束后所有實驗裸鼠均被安樂死,并做組織病理學檢查。

1.2.3.1 非局部晚期結腸癌(NALCC)模型的建立 實驗裸鼠用異氟烷吸入麻醉,取下腹部正中切口約5-10 mm進入腹腔;用31G針將含2×106個CT-26-Fluc的細胞懸液約50 μl水平接種到20只BALB/c裸鼠的結腸壁黏膜下層和肌層之間。全程在SMZ-B2/T2體視顯微鏡下操作。注射部位位于距盲腸根部約30 mm的結腸(相當于人升結腸段)。針插入深度約為0.5 mm。注射完成后,逐層縫合關閉腹腔。

1.2.3.2 分組及其處理 NALCC模型建立后隨機分為MALC組和假手術組,每組10只。1周后,MALC組施行顯微鏡輔助下以腫瘤為中心+周圍水腫腸管切除的區段切除手術,切除范圍為距腫瘤兩側緣約1 cm的腸段。收集切除腸段行術后病理檢查,明確病變性質。之后行結腸兩斷端端-端吻合。結腸吻合完成后,反復確認吻合口血供、有無梗阻、出血、滲漏等。確認完畢后,逐層關腹。操作全程在顯微鏡輔助下完成,所用機械均為微創手術機械,如眼科無損傷鑷、鼠類專用鈦夾、腸鉗或血管鉗以及10-0血管縫線等。而假手術組施行顯微鏡輔助下單純開關腹手術(MAOCS),不做腸切除。手術過程中注意維持裸鼠體溫。

1.2.4 解剖裸鼠和觀察指標 常規記錄實驗模型生存情況。手術3周后,在全麻狀態下處死所有模型。解剖過程中記錄血性腹水、腹膜、淋巴結及腹腔內臟器轉移情況,注意結腸吻合口或原位瘤組織生長情況。同時,還需注意胸腔及顱內等腹腔外組織有無轉移,凡可疑病灶均需及時取材送檢。

1.2.5 生物發光圖像 全麻和腹部皮膚消毒同上,利用無菌注射器將D-熒光素鉀鹽注入裸鼠腹腔內,約3 mg/只。IVIS活體成像系統和圖像軟件在6 min內即可對裸鼠體內腫瘤細胞生物發光信號進行收集和量化剖析,系統還可識別和測量感興趣區域(region of interest value, ROI值)內的腫瘤大小和腫瘤細胞數量。

1.2.6 組織病理學檢測 對所有從手術和尸檢中獲得的標本進行病理學檢測。將標本固定、脫水、透明和浸蠟后用石蠟包埋,按4 μm厚度切片;再用蘇木精-伊紅染色(HE染色)后顯微鏡下觀察檢測。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 兩組建模情況

BALB/c裸鼠NLACC模型成功率為100%(20/20),模型制作過程順利,無1例死亡。術后結腸原位腫瘤組織病理學檢測符合NLACC病理過程(見圖1)。兩組手術成功率和存活率均為100%。兩組在術中無1例死亡,且MALC組術后3周無1例出現腸梗阻、穿孔、出血、吻合口漏或死亡等情況,提示MALC在技術上是可行的。

2.2 影像學檢測分析

用IVIS系統定期檢測兩組模型術前和術后腫瘤的生物學信號(ROI值)。兩組術前影像學檢測提示NLACC模型的成瘤率為100%。影像學檢測結果提示,術后MALC組的ROI值較假手術組顯著下降,且較本組術前的ROI值明顯降低;而假手術組術后ROI值較術前顯著上升,且其敏感區域內的熒光面積呈進行性增大趨勢,差異均具有統計學意義(F=1 319.537,P<0.01),提示MALC對裸鼠NLACC可達到近似根治性切除(R0)的療效,且術后3周內無復發和轉移(見圖2)。

2.3 組織形態學和病理學檢查分析

手術3周后,在全麻下處死所有實驗裸鼠,并行組織病理學檢測。其中,MALC組裸鼠腹腔內未見復發和轉移病灶,且結腸吻合口愈合良好,無吻合口狹窄、近端腸管擴張和腸壁淤血等腸梗阻表現。病檢顯示吻合口符合瘢痕性愈合過程,腸壁未見腫瘤細胞浸潤(見圖3A-D)。而假手術組裸鼠的結腸原位瘤明顯突出于結腸腸壁,腸壁水腫、淤血明顯,所有裸鼠均呈現腸梗阻表現,病理學檢測提示腸壁結構破壞嚴重,腫瘤細胞已浸及腸壁全層(見圖3E-H);此外,假手術組裸鼠的腹腔內還可見散在的轉移性病灶,其中有4例出現血性腹水,1例出現淋巴結轉移,但未見肝轉移和腹膜種植轉移(見表1);血性腹水和淋巴結病檢均可見腫瘤細胞。由此可見,MALC不僅可到達臨床R0切除,且無吻合口狹窄、腸梗阻等手術并發癥,術后復發及轉移率也十分低。

A-C.MALC組裸鼠的解剖,無腹水、復發、轉移和腸梗阻;E-G.假手術組裸鼠的解剖,存在血性腹水、局部浸潤和腸梗阻等情況;D,H.分別為MALC組吻合口腸壁的HE染色(可見正常上皮細胞)和假手術組梗阻腸壁的HE染色(可見癌細胞浸潤)圖3 兩組裸鼠的組織標本大體觀和鏡下觀差異Figure 3 Macroscopic and microscopic appearance of tumor tissues after microscope-assisted surgery

表1 兩組結腸癌手術模型的組織病理學檢測結果Table 1 Comparison of histopathological results between two groups

3 討論

隨著精準醫學理念的不斷深化,前哨淋巴結導航手術(SNNS)[10]已被成功應用于早期乳腺癌[11,12]和早期胃癌[13]等疾病的精準外科治療。事實上,精準切除手術也已應用于較早期CRC的治療,如內鏡下黏膜切除術(EMR)、腫瘤的局部切除+前哨淋巴結清掃等。然而,目前這種精準化和縮小化的手術在結直腸癌臨床應用中仍存在一些爭議。因此,本研究通過構建理想的動物模型充分模擬結直腸癌病理學變化和其臨床治療情況,從而驗證精準切除在裸鼠NLACC治療中的可行性和安全性。

為制作精準切除模型,首要步驟就是理想的NLACC模型的制作。換句話說,我們應該選用與人結腸癌具有相似病理特征,并能充分模擬其臨床治療情形的動物模型。本實驗中,我們通過原位細胞微注射(OCMI)程序在BALB/c裸鼠結腸壁的黏膜下層注射結直腸癌細胞株形成了NLACC模型。通過無菌微吸管(31G)將高濃度的結腸癌細胞直接原位注射在黏膜下層沉積,黏膜下層靠近黏膜層,即人類結腸癌起始部位[14,15]。進入到結腸局部微環境中的腫瘤細胞,一旦建立了正確的相互作用,就可以自由遷移,到達黏膜下豐富的淋巴管和血管,從而通過血流擴散至鄰居器官或組織。這非常適合于需要在短時間內形成腫瘤的研究[16],也有助于提高腫瘤攝取率和傳播率。本實驗結果證實,裸鼠NLACC模型1周內的成瘤率為100%,且術后結腸原位腫瘤組織病理學檢測符合NLACC病理過程(見圖1)。因此,我們認為本研究建立的NLACC模型是一種能近似模擬人NLACC的有效模型。

此外,這類模型對于研究轉移級聯的后續過程也特別有效,包括淋巴或血源性轉移和器官移植轉移[17]。與轉基因或基因敲除小鼠相比,我們的NLACC模型不僅可在短期內形成腫瘤,而且更易發生侵襲和轉移。根據影像學檢測,我們的NLACC模型制作后2 d即可檢測到腫瘤信號,5 d即可顯示出明顯的腫瘤輪廓,且腫瘤大小隨時間延長呈進行性增長趨勢。而轉基因小鼠形成腫瘤前需較長的潛伏期(1.5-2年),而且是在小腸中而不是大腸,同時常顯示出與人類不同的繼發性基因突變[18]。而相比于腫瘤碎片結腸漿膜包埋方法(SOI),OCMI表現了不同的傳播能力的差異。雖然SOI能較早地發生轉移,但它只在肝臟或肝臟引流淋巴管中產生腫瘤灶[19,20],卻不能誘導向肺或結腸引流的淋巴管傳播。相反,OCMI程序允許腫瘤細胞浸潤腸壁的淋巴管,然后經腸系膜淋巴結-血流擴散-腹膜或遠處器官內形成轉移灶,如在人類結腸癌中觀察到的那樣[21]。并且,SOI模型因種植部位的限制,無法近似模擬早期結腸癌。本實驗中未發現肝轉移和其他遠處器官轉移,這考慮與細胞株本身的轉移能力和觀察期長短有關。已有研究表明,使用人結直腸癌細胞株的OCMI模型,可見較多的肝轉移和其他轉移[16]。因此,我們認為本研究建立的NLACC模型可近似地模擬臨床早期結腸癌的病理學變化過程。不僅如此,在建模中,采用了全麻、全程顯微鏡下操作、成角注射和局部加壓等細節上的處理以及前期的大量預實驗,也大大提高了模型的可信度和準確性。

近年來,雖然動物模型種類越來越多,但目前還沒有關于結直腸癌動物手術模型的報道。因此,我們在模擬臨床早期結腸癌病理過程的基礎上建立了一種裸鼠NLACC的精準切除模型,即MALC模型。實驗的設計理念來源于早期結腸癌的腫瘤局部切除+前哨淋巴結清掃和早期直腸癌的全系膜切除術的精準切除概念的更新[22,23]。由于嚙齒動物自身的局限性,難以用肉眼或放大鏡進行精確的根治性手術,我們選擇了以腫瘤為中心的局部切除和周圍水腫腸管切除的區段性切除手術。根據本實驗結果,MALC組模型施行MALC手術,假手術組施行MAOCS手術,雖然兩種手術刺激強度不同,但是兩組模型在術后3周內均無1例死亡,考慮手術刺激強度對結果影響較小;不僅如此,MALC模型術后無腸穿孔或梗阻、出血、感染和吻合口漏等并發癥的出現,且其術后無復發和轉移。病理學和影像學檢測均顯示相同結果。這提示MALC精準切除手術不僅具有可操作性和有效性,其在腫瘤學行為上也具有安全性和可靠性。臨床研究數據表明,仍有部分局限性黏膜下浸潤性結腸癌可能存在淋巴結轉移,而且一些新的無癥狀的腫瘤也存在持續的風險,如晚期腺瘤和早期錯時結腸癌[24],而這些往往因漏診而失去最佳治療時機,本研究建立的模型或許可以為此提供研究基礎。此外,為了提高模型的可靠性,我們還做了很多其他的工作。首先,全麻的選擇有利于手術的順利實施。其次,顯微鏡放大倍數可達4-40倍,可保證手術視野的清晰度。接下來,針對小鼠的特殊手術器械和精細縫線也為實施精準手術提供了有利條件。同時,為了掌握顯微鏡下腸吻合技術,我們從斷開橡膠手套的連續縫合到顯微鏡下實驗小鼠腸管的熟練吻合進行了大量的初步實驗。因此,我們相信我們的MALC模型在技術層面上是可行的,在腫瘤學行為上也十分安全可靠的。

綜上所述,針對裸鼠非局部晚期結腸癌的精準切除手術MALC不僅能達到根治性切除療效,其術后并發癥發生率和腫瘤復發率均較低。換句話說,本研究建立的MALC模型不僅在技術上具有可行性,而且其在腫瘤學行為上具有安全性和可靠性。同時,我們認為MALC模型可以被視為是一種可量化和可靠的非局部晚期結腸癌精準手術模型,可用于評價新基因治療、化療和放療的相關研究。這是動物模型研究的新嘗試和突破。我們歡迎其他研究人員復制我們的模型,并利用它們開發新的治療策略。