黃芪理中湯抑制間歇性缺氧誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用研究

許愛(ài)婷，陳劍坤，李際強(qiáng)，梁浩斌，費(fèi)春羨（通訊作者）

（1廣東省陽(yáng)江市人民醫(yī)院老年病科 廣東 陽(yáng)江 529500）

（2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院綜合三科 廣東 廣州 510006）

阻塞性睡眠呼吸暫停（OSA）是一種臨床常見(jiàn)疾病，以睡眠時(shí)反復(fù)上氣道塌陷導(dǎo)致打鼾、頻繁呼吸暫停及呼吸淺慢、低氧血癥、睡眠中斷、白天嗜睡為主要表現(xiàn)的臨床綜合征[1-3]。OSA特征性表現(xiàn)為間歇性低氧和（或）缺氧，器官或組織慢性間歇性缺氧（CIH）誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生游離氧自由基，釋放炎癥介質(zhì)（IL-6、TNF-α和C-反應(yīng)蛋白），誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能障礙以及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[4]，進(jìn)一步導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生[5]。黃芪理中湯是《千金方》中健脾益氣經(jīng)典方，由黃芪、川芎、桂枝等中藥組成，具有補(bǔ)氣溫陽(yáng)，活血通絡(luò)的功效。黃芪理中湯是否能夠抑制間歇性缺氧體外心肌細(xì)胞模型細(xì)胞凋亡，目前尚未明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立CIH誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）模型，觀察黃芪理中湯對(duì)間歇性缺氧誘導(dǎo)的HUVEC凋亡的影響。

1.資料與方法

1.1 一般資料

本研究于2019年10月—2020年8月進(jìn)行，HUVEC細(xì)胞購(gòu)于武漢中國(guó)生物樣品典藏中心，黃芪理中湯處方中各味中藥購(gòu)自康美藥業(yè)，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自GIBCO，細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自凱基生物，Caspase-3試劑盒購(gòu)自碧云天，Trizol構(gòu)自invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 黃芪理中湯的制備 根據(jù)黃芪理中湯處方，加8倍水，浸泡25 min，武火加熱至沸，文火煎煮40 min，過(guò)濾；濾渣繼續(xù)加8倍量水，武火加熱至沸，文火煎煮40 min，過(guò)濾，合并濾液，低溫減壓回收溶劑至浸膏后，低溫真空干燥，即得黃芪理中湯干膏樣品。

1.2.2 黃芪理中湯含藥血清制備 將SD大鼠隨機(jī)分為黃芪理中湯組15只，空白組15只，黃芪理中湯給藥劑量為4.5 g/kg，2次/d，連續(xù)7 d。最后1次灌藥前禁食不禁水12 h，末次給藥后2 h水合氯醛麻醉，心尖取血，2 000 r/min離心15 min取血清，同組混合以消除個(gè)體差異，56℃滅活30 min，0.22μM過(guò)濾除菌后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 CIH誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC體外損傷模型 本實(shí)驗(yàn)采用的細(xì)胞為人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC細(xì)胞，細(xì)胞CIH造模在低氧培養(yǎng)箱即Oxycycler model C21內(nèi)完成，人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC在暴露于常氧或IH（6 h）之前，細(xì)胞同步培養(yǎng)24 h,Oxycycler model C21內(nèi)IH細(xì)胞造模條件為：5% O25 min，10 min 21% O2，以此循環(huán)24 h制備CIH造模。細(xì)胞分組包括：（1）空白對(duì)照組：10%空白血清+90%DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；（2）CIH模型組：10%空白血清+90%DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；（3）黃芪理中湯低、中、高劑量組：給予2.5%黃芪理中湯血清+7.5%空白血清+90%DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，5%黃芪理中湯血清+5%空白血清+90%DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，10%黃芪理中湯血清+90%DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，作用24 h。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞以每孔2×104個(gè)細(xì)胞，100μL培養(yǎng)基鋪96孔培養(yǎng)板中，按照不同分組進(jìn)行處理，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，加入10μL MTT試劑充分混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入裂解液（20% SDS，50% DMSO, pH 4.7）過(guò)夜，酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將HUVEC細(xì)胞以每孔2×105個(gè)細(xì)胞密度接種于6孔板中，每孔2 mL。待細(xì)胞貼壁按照不同分組進(jìn)行處理。24 h后，收集細(xì)胞離心，細(xì)胞用PBS清洗1次，在binding緩沖液中重懸細(xì)胞，使用Annexin VFITC/PI雙染檢測(cè)（5μL Annexin VFITC和5μL PI避光靜置15 min），最后在流式細(xì)胞儀FACS Calibur系統(tǒng)中分析。

1.2.6 分光光度法檢測(cè)細(xì)胞Caspase 3活性 將HUVEC細(xì)胞以每孔2×105個(gè)細(xì)胞密度接種于6孔板中，每孔2 mL，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行不同分組處理，24 h之后收集各組細(xì)胞上清液各20μL在96孔板中，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，于450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各組吸光值。

1.2.7 RT-PCR檢測(cè)HUVEC中凋亡相關(guān)蛋白Bim的表達(dá) 收集HUVEC細(xì)胞，將Trizol液550μL加入細(xì)胞中，吹打混勻加入氯仿200μL，渦旋混勻后靜置5 min，12 000 r/min，4℃離心15 min，取上清液。加入等體積預(yù)冷的異丙醇，渦旋混勻后靜置5 min，12 000 r/min，4℃離心10 min，加入含75%乙醇的無(wú)酶水1 mL并混勻，清洗RNA沉淀，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清液，用15μL無(wú)菌DEPC水60 ℃，10 min加熱溶解沉淀。按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA.PCR引物經(jīng)Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，由生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列，見(jiàn)表1。

PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系10μL，SYBR Premix ExTaq 5μL，ROX Reference Dye（50×）0.2μL，去離子水3μL，上下游引物各0.4μL，模板cDNA 1μL。反應(yīng)過(guò)程如下：95 ℃預(yù)變性3 min，進(jìn)入循環(huán)，在95 ℃變性30 s，退火0.05 s，延伸34 s，循環(huán)次數(shù)均為40次。以GAPDH作為內(nèi)參，將所得Ct值按2-△△Ct方法進(jìn)行處理，見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism7.0和IBM SPSS Statistics 24.0軟件分析。計(jì)量資料滿足正態(tài)分布，采用（±s）描述；滿足正態(tài)性但不滿足方差齊性的多組獨(dú)立計(jì)量資料比較采用單因素ANOVA方差分析進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 黃芪理中湯對(duì)CIH誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞增殖的作用

MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果表明，與空白組細(xì)胞比，CIH組細(xì)胞增殖率明顯降低；與CIH組比，0.625%～15%濃度的黃芪理中湯含藥血清明顯促進(jìn)HUVEC細(xì)胞增殖。根據(jù)結(jié)果，選用2.5%、5%和10%作為后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)黃芪理中湯含藥血清的給藥濃度，見(jiàn)圖1。

間歇性缺氧黃芪理中湯含藥血清（%）圖1 黃芪理中湯對(duì)CIH誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞增殖的影響

2.2 黃芪理中湯對(duì)CIH誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞凋亡的作用

不同濃度的黃芪理中湯含藥血清處理CIH誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞24 h后，對(duì)各組HUVEC細(xì)胞的凋亡率進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，與空白組細(xì)胞比，CIH組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.001）；與CIH組比，2.5%、5%和10%濃度的黃芪理中湯含藥血清明顯抑制HUVEC細(xì)胞凋亡率（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

間歇性缺氧黃芪理中湯含藥血清（%）圖2 黃芪理中湯抑制CIH誘導(dǎo)HUVEC損傷模型細(xì)胞凋亡

2.3 黃芪理中湯對(duì)CIH誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞Caspase-3的作用

與空白組細(xì)胞比，CIH組HUVEC細(xì)胞Caspase-3活性顯著升高；與CIH組比，不同濃度的黃芪理中湯含藥血清明顯抑制CIH誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞中Caspase-3活性，并且具有劑量依賴性，見(jiàn)圖3。

間歇性缺氧黃芪理中湯含藥血清（%）圖3 黃芪理中湯對(duì)CIH誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞Caspase-3活性的影響

2.4 黃芪理中湯對(duì)CIH誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白Bim的作用

RT-PCR結(jié)果表明，與空白組比，CIH組HUVEC細(xì)胞中凋亡誘導(dǎo)蛋白Bim表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001）；與CIH組比，5%和10%濃度的黃芪理中湯含藥血清明顯下調(diào)HUVEC細(xì)胞中Bim的mRNA表達(dá)水平（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

間歇性缺氧黃芪理中湯含藥血清（%）圖4 黃芪理中湯下調(diào)CIH誘導(dǎo)HUVEC損傷模型凋亡蛋白Bim的mRNA

3.討論

阻塞性睡眠呼吸暫停（OSA）患者中有50%的人群患有心血管疾病，此外50%以上的高血壓患者[6]和30%以上的冠狀動(dòng)脈疾病患者[7]均合并OSA. OSA能夠增加高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化（AS）、冠心病、心力衰竭、心源性猝死等心血管疾病及事件的風(fēng)險(xiǎn)[8-9]，被認(rèn)為是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[10]。近年來(lái)OSA相關(guān)心血管疾病的機(jī)制及防治越來(lái)越受到關(guān)注，成為了新的研究熱點(diǎn)[11]。尋找有效治療OSA心血管損傷藥物，對(duì)于干預(yù)OSA相關(guān)心血管疾病具有重要意義。

益氣活血中藥具有抗炎、抗氧化、改善胰島素抵抗、保護(hù)血管內(nèi)皮、改善動(dòng)脈粥樣硬化等作用，且已在臨床及基礎(chǔ)研究中得到驗(yàn)證[12-13]。黃芪理中湯是《千金方》中健脾益氣經(jīng)典方，由黃芪、川芎、桂枝等中藥組成，具有補(bǔ)氣溫陽(yáng)，活血通絡(luò)的功效。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪理中湯主要有效成分黃芪甲苷可以通過(guò)抑制TLR-4介導(dǎo)的NF-κB/MAPK信號(hào)通路緩解間歇性缺氧誘導(dǎo)的肺上皮Beas-2B細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激水平[14]。川芎有效成分川芎嗪具有清除自由基，拮抗細(xì)胞鈣離子，抑制血小板聚集，保護(hù)心血管內(nèi)皮細(xì)胞等藥理作用[15]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)黃芪理中湯可以通過(guò)下調(diào)凋亡誘導(dǎo)蛋白Bim的表達(dá)，抑制Caspase-3活性，進(jìn)而抑制CIH誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞凋亡，促進(jìn)CIH誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果不僅可以闡釋黃芪理中湯治療OSA心血管損傷的藥理內(nèi)涵，同時(shí)將為中西醫(yī)結(jié)合臨床防治OSA相關(guān)心血管疾病提供新的思路。