慢性化膿性中耳炎的病原學、藥敏試驗及其毒力基因分析

陶興罡，張志遠

(1.南昌大學第一附屬醫院耳鼻咽喉科，南昌 330006； 2.復旦大學附屬中山醫院吳淞醫院耳鼻咽喉科，上海 200940)

慢性化膿性中耳炎(chronic suppurative otitis media，CSOM)是一種較為常見的耳科疾病，臨床上患者以耳痛、耳鳴、耳內長期反復間斷或持續性流膿、鼓膜穿孔、伴有或不伴有聽力下降為主要臨床特點。國內外很多研究者[1-4]對CSOM分離出的致病菌類型進行了分析，各地區常見致病菌類型有所差異。隨著抗生素的使用，CSOM的致病菌譜及藥物敏感性也會隨之變化。而關于CSOM的毒力基因研究少有文獻報道。因此，本研究分析CSOM患者的細菌分型及藥物敏感性，并對相關致病菌的毒力基因進行檢測，觀察病原菌譜和耐藥性的變化，為臨床合理治療CSOM提供用藥參考。

1 一般資料

選取2020年3月至2021年3月在復旦大學附屬中山醫院吳淞醫院就診的CSOM患者166例患者(179只患耳)，男76例，女90例，年齡(49.31±12.44)歲，病程2個月～26年，平均21.2個月。

1.1 病例選取標準

1)納入標準：①符合慢性化膿性中耳炎的診斷標準；②近期內(5 d)未使用過抗菌藥物；③均為化膿性中耳炎活動期。

2)排除標準：①排除疾病，包括外耳道膽脂瘤、中耳膽脂瘤、中耳膽固醇肉芽腫、結核性中耳炎、中耳癌;②5 d內使用過抗生素，包括滴耳液、口服、肌肉、靜脈。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑與儀器

由上海伊華醫學生物提供的血瓊脂培養基、巧克力瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基、念珠菌顯色瓊脂培養基、沙保弱瓊脂培養基等，安圖MS1000質譜儀、生物梅里埃公司的Vitec 2微生物鑒定藥敏分析系統和Vitec Densichek比濁儀。北京六一儀器廠生產的DYY-6C電泳儀和DYCP-32B電泳槽用于蛋白電泳實驗。

1.2.2 病原學和藥敏試驗

按照《全國臨床檢驗操作規程》[5]中耳分泌物標本進行檢驗操作。用無菌棉簽采集門診或入院確診患者中耳鼓室分泌物，置于無菌試管中立即送檢，進行細菌和真菌培養，培養陽性菌株應用安圖MS1000質譜儀進行質譜鑒定。

生物梅里埃公司的Vitec 2微生物鑒定藥敏分析系統和Vitec Densichek比濁儀進行藥敏試驗，補充藥敏試驗采用K-B藥敏紙片擴散法技術，藥敏試驗方案參考全國細菌耐藥監測網技術方案(CARSS網，http://www.carss.cn)，藥敏試驗執行標準為2020抗微生物藥物敏感性試驗執行標準CLSI M100-30(中國藥師協會根據美國臨床和實驗室標準協會合法授權翻譯印制)。

1.2.3 毒力基因測試

依據GenBank對外公布的毒力基因序列，采用Primer Premier 5引物軟件，根據相關文獻[6-8]，設計金黃色葡萄球菌毒力基因SEA、SEB、TSST-1、HLα、HLβ、PLV和銅綠假單胞菌毒力基因ToxA、ExoT引物。菌株采用酶解法，提取DNA，PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳，成像觀察。毒力基因引物序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成，詳見表1。

表1 基因引物序列

1.3 數據處理

采用Excel 2010錄入數據，應用SPSS 20.0軟件對數據進行處理。

2 結果

2.1 致病菌種類分布

166例患者(179只患耳)的中耳分泌物標本中，132例患者(143只患耳)培養出致病菌，檢出率為79.89%(143/179)。共培養出167株致病菌，其中24例患耳存在2種致病菌混合感染。

167株致病菌中，革蘭陽性菌81株(占48.50%)，其中金黃色葡萄球菌50株(占29.94%)，凝固酶陰性葡萄球菌19株(占11.38%)；革蘭陰性菌22株(占13.17%)，其中銅綠假單胞菌12株(占7.19%)；真菌64株(占38.55%)，其中絲狀真菌44株(占26.35%)。見表2。

表2 致病菌分布及各自比例

表2(續)

2.2 致病菌藥敏試驗分析

對50株金黃色葡萄球菌和12株銅綠假單胞菌進行耐藥分析。真菌未做藥敏試驗。

金黃色葡萄球菌對青霉素G的耐藥率最高為90.00%。耐藥率超30%的還有紅霉素(32.00%)和氨芐西林(30.00%)，見圖1。銅綠假單胞菌耐藥率最高的是環丙沙星(25.00%)和左旋氧氟沙星(25.00%)，見圖2。

圖1 金黃色葡萄球菌的耐藥情況(n=50)

圖2 銅綠假單胞菌的耐藥情況(n=12)

2.3 毒力基因

金黃色葡萄球菌的毒力基因SEA、SEB、TSST-1、HLα、HLβ、PLV中，HLα的檢出率最高，達100%；銅綠假單胞菌的毒力基因ToxA、ExoT中，ToxA的檢出率最高達100%，見表3。各毒力基因電泳結果見圖3—4。

表3 金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌毒力基因檢出情況

1—24:金黃色葡萄球菌;M:marker。圖3 金黃色葡萄球菌各毒力基因電泳結果

圖3(續)

1—6:銅綠假單胞菌;M:marker。圖4 銅綠假單胞菌各毒力基因電泳結果

3 討論

成年人CSOM的發病率在國內一般為2%～4%[9]，占耳鼻喉科新診斷患者的11.7%。常合并慢性乳突炎，中耳腔內的膿性分泌物以感染的細菌、白細胞、巨噬細胞等為主，發病時間通常定義為8周以上。長期的炎癥病理改變會破壞中耳的生理結構，導致聽力損失，甚至破壞周圍的骨質。在一定條件下，可出現嚴重的顱內、外并發癥而危及生命[10]。感染、咽鼓管功能障礙及免疫不健全是中耳炎的三大主要發病病因[11]，致病菌感染是引起CSOM的最重要和最直接的外源性病因。

國內外很多研究者對CSOM分離出的致病菌類型進行了分析。上海的金曉杰等[1]研究62例CSOM患者的致病菌，依照實際的檢出占比為銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌等。楊燕珍等[2]收集武漢市92例CSOM患者的中耳炎性分泌物并做細菌培養，結果致病菌是綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和變形桿菌等。王志紅等[3]收集化膿性中耳炎耳道分泌物80例進行細菌培養，結果顯示，致病菌為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及銅綠假單胞菌等。韓國學者YEO等[4]回顧性分析1102名罹患CSOM患者致病菌排列為：假單胞菌屬、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌等。提示，CSOM的常見致病菌類型因地區而異。

本研究中凝固酶陰性葡萄球菌(頭狀葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、耳葡萄球菌、假中間葡萄球菌等)占11.38%，因其致病性存在爭議[12]，故暫不作為致病菌參與比例排序。故排名前三位的致病菌檢出率為金黃色葡萄球菌50株(29.94%)、絲狀真菌44株(26.35%)、銅綠假單胞菌12株(7.19%)。與金曉杰等[1]在2004年提出的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的比例順序已完全不同。其中，金黃色葡萄球菌的檢出明顯增多，且真菌的檢出比例上升到第二位。可能與上海處于我國的長江下游地區，環境溫暖濕潤，適合真菌生長有關。另外，也可能與長期不規范使用抗生素，造成局部菌群失調有關。本研究中24例患耳存在2種致病菌混合感染，可能是自行使用抗生素治療各種炎癥，造成局部或全身的菌群紊亂。

本研究總致病菌的耐藥試驗結果顯示，革蘭陽性菌，特別是金黃色葡萄球菌對青霉素G的耐藥率最高，遠超《抗菌藥物臨床應用指導原則》和《抗菌藥物臨床應用管理辦法》[13-14]的慎重用藥的標準，在金黃色葡萄球菌作為目標細菌的治療中，建議暫停青霉素G。而耐藥率超30%的紅霉素、氨芐西林，也應慎用。革蘭陰性菌，尤其是銅綠假單胞菌，對環丙沙星和左旋氧氟沙星的耐藥率最高，雖未達到用藥預警，但仍需注意目前對β-內酰胺類抗生素、喹諾酮類藥物的耐藥性，有明顯升高。參考“全國細菌耐藥監測網(CARSS)”[15]，2019年金黃色葡萄球菌對常用抗菌藥物的敏感性表中，耐藥率前五位與此次CSOM分離出金黃色葡萄球菌的耐藥率前五位的結果順序基本一致。2019年銅綠假單胞菌對常用抗菌藥物的敏感性表中，耐藥率前五位與此次CSOM分離出銅綠假單胞菌的耐藥率前五位結果順序基本相近。提示CSOM的致病菌，與全身其他部位的相同致病菌，對抗生素的耐藥效果基本相似。

細菌致病力的強弱，主要取決于其產生的各種毒力基因。此次實驗中，金黃色葡萄球菌的毒力基因中，HLα基因檢出率最高，達100%。HLα基因，是金黃色葡萄球菌分泌的外毒素——溶血毒素的α毒素，在感染致病過程中，具有破壞宿主細胞免疫屏障的能力，是關鍵因子之一，并參與金黃色葡萄球菌的生物膜生成[16]，與其致病性密切相關。而細菌生物膜在CSOM發病機制中已經引起廣泛的關注[17]。生物膜難以根除，還可能導致復發性感染。此外，生物膜與受損組織，如暴露的骨組織和潰爛的中耳黏膜，或耳科植入物如鼓膜置管，緊密相連，進一步加劇了治療困難[18]。

銅綠假單胞菌的毒力基因中，ToxA的檢出率最高，達100%。ToxA基因，由Ⅱ型分泌系統產生，其表達的外毒素，細菌毒力極強，可導致宿主細胞蛋白質合成障礙。因此，銅綠假單胞菌感染造成的CSOM，比其他致病菌更有致病性。

盡管各種毒力基因的檢出率各不相同，但是，這些毒力基因共同參與細菌的致病作用。例如，金黃色葡萄球菌的黏附和定植需要表面錨定蛋白和HLβ基因的參與，HLα、HLβ、PVL基因協同損傷細胞膜，HLα、HLβ基因共同降低纖毛功能，SEA、SEB基因發揮毒素效應，TSST-1基因增強對毒素敏感性，共同參與CSOM的致病過程。而銅綠假單胞菌的ToxA和ExoT基因，則抑制靶細胞的蛋白質合成和細胞分裂，使細胞凋亡[19]和組織壞死。同樣將CSOM的致病力，發揮到了極致。

總之，隨著檢測方法的更新，治療藥物的升級，致病菌譜必定會有變化。因此，應動態監測病原學的變化，及時總結致病菌檢出率的排序變化、細菌的耐藥率和耐藥特點等，并且更新使用針對性的抗菌藥物進行治療。臨床盡可能對每位患者進行細菌培養和藥敏試驗，特別是對抗菌治療效果差，或伴有糖尿病、結核病等消耗性疾病的機會性感染患者更是如此。依據細菌培養與藥敏試驗結果，合理、規范、有針對性地使用抗生素，不僅可以縮短病程，減少并發癥，還可以減少耐藥性的發生。致病菌的培養鑒定、藥敏試驗分析及其毒力基因的檢測，可為臨床合理用藥提供科學參考，進一步促進個體化治療，精準化治療。同時，衛生管理部門應繼續加強對抗菌藥物的管理，加大監督和指導的力度；醫療機構應嚴格控制對抗菌藥物的臨床應用指征；應該通過各種渠道宣傳濫用抗菌藥物的危害，增強遵守醫囑的自覺性，避免過度使用抗菌藥物。

致謝：特此感謝劉洋師兄對論文的悉心指導！