基于UPLC-MS/MS分析黑果枸杞中多糖的研究

李 晶，邢麗杰，王 遠，羅瑞峰，盧士玲

（1.石河子大學 食品學院，新疆 石河子 832000；2.新疆農墾科學院，新疆石河子 832000；3.新疆生產建設兵團食品檢驗所，新疆石河子 832000）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr）.中含有許多的功能營養成分，如花青素、多糖、礦物質、多酚、有機酸和類胡蘿卜素等[1-4]，其中黑果枸杞多糖被認為是黑果枸杞中最重要的功能物質。多糖已被證實具有抗氧化[5]、免疫調節[6-7]、抗癌[8-9]、神經保護[10]和抗衰老[11]等生物活性功能，此外多糖還能有效緩解疲勞、加速新陳代謝、控制血糖和保護視網膜[12-14]。

目前，測定多糖的方法包括高光譜成像法[15]、離子交換分離-脈沖安培法[16]、高效液相色譜法[17]、高效液相色譜串聯質譜法[18]。其中，高光譜成像法多用于總糖含量的測定；離子交換分離-脈沖安培法和高效液相色譜法可用于分離不同多糖，同時能定性定量；高效液相色譜串聯質譜法測定多糖不需要衍生，且定性更加準確。試驗建立了超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS/MS）測定黑果枸杞中蔗糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、棉子糖、甘露糖含量的方法，并對黑果枸杞多糖進行分析測定。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

蔗糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、棉子糖、甘露糖（純度大于99%），德國Dr.Ehrenstorfer公司提供；乙腈（色譜純），德國CNW公司提供；氨水（純度25%，優級純）；黑果枸杞。

1.2 儀器與設備

QCA657型超高效液相色譜串聯質譜儀（waters TQ-S），美國waters公司產品；ULPHW-IV型超純水儀，四川優普超純科技有限公司產品；KQ-600DE型超聲波儀，昆山市超聲儀器有限公司產品；HHS11-2型水浴鍋，金壇市精達儀器制造有限公司產品；DHP-9082型烘箱，上海一恒科學儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 預處理

將干燥的黑果枸杞粉碎過60目篩，石油醚脫脂，料液比1∶3浸泡過夜，棄去石油醚，二次脫脂料液比1∶2，揮干石油醚，55℃下烘干，過篩60目篩，備用。

1.3.2 標準溶液的配制及樣品處理

分別準確稱取蔗糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、棉子糖和甘露糖標準品各100 mg于10 mL容量瓶中，以50%乙腈為溶劑，配制成質量濃度為10.0 mg/mL的單個多糖標準儲備液；再分別移取適量10.0 mg/mL的單個多糖標準儲備液，用50%乙腈溶液稀釋成1.0，10.0，50.0，100.0，200.0μg/mL質量濃度的混合多糖系列標準工作液。

稱取1.00 g黑果枸杞樣品，經30 mL 90℃熱水浸提，浸提60 min，然后再加入50 mL乙腈，用純水定容至100 mL，過0.22μm濾膜，待UPLC-MS/MS分析。

1.3.3 色譜條件及質譜條件

色譜柱：Acquity BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；流動相A：0.1%氨水溶液，流動相B：含0.1%氨水-乙腈溶液；流速0.3 mL/min，進樣量3.0μL，柱溫35℃；梯度洗脫程序：0~10 min，20%~45%A；10~12 min，45%~45%A；12~12.01 min，45%~20%A，運行時間15 min。

電噴霧離子源，負離子模式掃描，離子源溫度150℃，脫溶劑氣800 L/h，干燥氣溫度400℃，錐孔氣50 L/h，毛細管電壓2.5 kV。

7種多糖的離子對、錐孔電壓和碰撞能量見表1。

表1 7種多糖的離子對、錐孔電壓和碰撞能量

2 結果與分析

采用UPLC-MS/MS法測定。

2.1 總離子流圖

由于多糖分子結構中含有多羥基基團，在離子化過程中易失去氫離子而形成負離子，所以采用電噴霧負離子源進行離子化。在1.3.3中色譜和質譜條件下，較好地分離黑果枸杞中鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、蔗糖和棉子糖等7種多糖。

7種單糖總離子流圖見圖1。

圖1 7種單糖總離子流圖

2.2 線性范圍與檢出限

按1.3.2中配制7種多糖混合系列標準工作液，在1.3.3中色譜和質譜條件下，以樣品的峰面積（Y）對質量濃度（X，μg/mL） 進行線性擬合，同時按3倍RSN計算檢出限和10倍RSN計算定量限。7種多糖均在1.0~100.0μg/mL范圍呈良好線性關系，相關系數均大于0.99，7種多糖的檢出限均為5 mg/kg，定量限均為10 mg/kg。

7種多糖的線性回歸方程和線性相關系數、檢出限見表2。

表2 7種多糖的線性回歸方程和線性相關系數、檢出限

2.3 實際樣品測定

采用優化后的UPLC-MS/MS法對黑果枸杞進行測定，結果表明黑果枸杞中檢出阿拉伯糖11.7 g/kg，葡萄糖35.4 g/kg，甘露糖未檢出，棉子糖1.4 g/kg，鼠李糖未檢出，果糖12.7 g/kg和蔗糖2.1 g/kg。

3 結論

建立了UPLC-MS/MS快速測定黑果枸杞中阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、棉子糖、鼠李糖、果糖和蔗糖含量的方法，并應用UPLC-MS/MS對黑果枸杞樣品進行了分析測定，結果表明7種多糖線性關系良好，該檢測方法簡單、靈敏度高，適用于黑果枸杞中多糖的測定。