桑葉多酚的提取及其體外抗氧化能力測定

馮淦熠 楊浩然 項 軒 殷 磊 賀 喜 曹 蓉*

(1. 湖南農業大學動物科學技術學院，湖南畜禽安全生產協同創新中心，長沙410128； 2.中國科學院亞熱帶農業生態研究所，長沙410125)

桑葉是桑科植物桑(MorusalbaL.)的干燥葉，具有良好的食用價值和藥用價值。桑葉中含有豐富的維生素、礦物質以及生物堿、黃酮、多糖和多酚等活性成分，具有降血糖、降血脂、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒和抑菌等功效。其中，多酚類物質作為構成桑葉抗氧化能力的重要物質基礎之一，近年來研究主要集中在其最優提取工藝和體內抗氧化作用等方面，而對桑葉體外抗氧化作用與其所含多酚類物質之間的量效關系的研究甚少。因此，本試驗測定了在不同濃度(60%、70%、80%)的乙醇提取條件下桑葉多酚的絕對量和含量，分析了各組之間的差異情況；并選定其中桑葉多酚的絕對量和含量最高的60%乙醇提取組，經過不同倍數的稀釋處理后再次測定其多酚的絕對量、含量和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除率，并以水溶性維生素E(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox)為陽性對照，以半抑制濃度(IC50)為參考依據，分析了各乙醇提取組的不同稀釋水平之間體外抗氧化能力的差異情況，將多酚絕對量與IC50進行了相關性分析，并構建擬合方程，為揭示桑葉多酚含量與其體外抗氧化能力之間的量效關系提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

桑葉采摘于國家中藥材(湖南)生產技術中心。新鮮桑葉樣品經65 ℃烘干至恒重，粉碎后過60目篩后備用。

主要試劑：DPPH、福林酚(Folin-ciocalteu)試劑、沒食子酸(分析純)、乙醇(分析純)、冰醋酸(分析純)、醋酸鈉(分析純)、Trolox、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)。

主要儀器：HC-100T型多功能粉碎機(廣東河城工貿有限公司)、FA1004B型分析天平(上海越平科學儀器有限公司)、SHZ-82型氣浴恒溫振蕩器(江蘇省常州市華普達教學儀器有限公司)、MH-1500S型超聲波清洗器(湖南米函儀器科技有限公司)、帝肯Infinite F50型酶標儀(瑞士Tecan公司)、85-2型恒溫磁力攪拌器(江蘇省常州市國華儀器制造有限公司)、PH-10/100型筆式酸度計(上海邦西儀器科技有限公司)。

1.2 桑葉多酚提取液的制備

準確稱取1.0 g桑葉粉碎樣品18份，分為3組，每組6份，分別溶解于25 mL 60%、70%、80%的乙醇溶液中，在70 ℃恒溫水浴鍋加熱30 min后，經功率為240 W的超聲波提取10 min，迅速趁熱過濾，合并濾液，最終共計得到18份桑葉多酚提取液，儲藏于4 ℃冰箱中備用。

1.3 桑葉多酚絕對量及含量的測定

試驗參考Folin-ciocalteu法測定并加以改進。以沒食子酸為標樣，在可見光區595 nm處測定吸光度，不同濃度(60%、70%、80%)的乙醇提取組各設3個重復樣品孔。以沒食子酸濃度為橫坐標，所測吸光度為縱坐標，測定桑葉多酚標準曲線為Y=1.219 7X+0.008 6 (R2=0.993 8)(圖1)。桑葉多酚絕對量和含量計算公式為：

圖1 桑葉多酚標準曲線

桑葉多酚絕對量(mg/mL)=(A1-A2- 0.008 6)/1.219 7； 桑葉多酚含量(mg/g)=桑葉多酚絕對量×V/M。

式中：A1為10 μL桑葉多酚提取液+200 μL 2% Na2CO3+10 μL 50% Folin-ciocalteu試劑混合液的吸光度；A2為220 μL純水的吸光度；M為所稱取的桑葉樣品質量(g)；V為每份桑葉多酚提取液的總體積(mL)。

1.4 桑葉多酚提取液的稀釋

選取桑葉多酚含量最高組的桑葉多酚提取液，將其進行逐級稀釋，分別稀釋至原來的25%、50%、75%后，參照1.3所述方法測定各稀釋組的桑葉多酚絕對量和含量。

1.5 DPPH自由基清除率的測定

試驗參考符晨星等的方法測定，并加以改進。預先配制25 mL 0.1 mol/L醋酸和200 mL 0.1 mol/L醋酸鈉，將兩者混勻后，調節pH至5.5，制成0.1 mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液；將0.1 mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液與70%的乙醇溶液按10∶9的體積比混合均勻，制成試驗Buffer液；配制0.2 mg/mL DPPH乙醇溶液。

稱取5 mg Trolox粉末，溶解于1 mL DMSO中，隨后稀釋成試驗所需的5個濃度，分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL。以不同濃度的Trolox溶液及其相應的清除率繪制標準曲線。經酶標儀測定，Trolox標準曲線為Y=-0.755 6X+0.584 2 (R2=0.994 0)(圖2)。以Trolox清除DPPH自由基的能力為陽性對照，對桑葉多酚提取液的體外抗氧化能力進行評價。DPPH自由基清除率計算公式為：

圖2 Trolox標準曲線

DPPH自由基清除率(%)=1-[(1- A2-A3)/(A4-A3)]。

式中：A1為5μL桑葉多酚提取液+5μL純水+190μL試驗Buffer+50μLDPPH混合液的吸光度；A2為10μL桑葉多酚提取液+240μL純水混合液的吸光度；A3為250μL純水的吸光度；A4為200μLBuffer+50μLDPPH混合液的吸光度。

將不同混合液溶解于96孔板中，混合均勻。室溫避光孵育30min后，于517nm的波長下檢測吸光度，不同濃度的乙醇提取組各設3個重復樣品孔。

1.6 桑葉多酚提取液的稀釋

對各組桑葉多酚提取液進行稀釋處理，分別將桑葉多酚提取液稀釋2、4、8、16倍，參照1.5所述方法測定各稀釋組的DPPH自由基清除率。

1.7 數據統計分析

所有試驗數據采用SPSS 20.0軟件中的ANOVA過程進行單因子方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，差異顯著時用Duncan氏法進行多重比較。結果采用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 乙醇濃度對桑葉多酚絕對量和含量的影響

如表1所示，60%乙醇提取組的桑葉多酚絕對量和含量最高，但各提取組之間無顯著差異(P>0.05)。

表1 乙醇濃度對桑葉多酚絕對量和含量的影響

2.2 稀釋處理對桑葉多酚絕對量和含量的影響

選取多酚絕對量和含量最高的60%乙醇提取組，將該組的桑葉多酚提取液分別稀釋至原液的25%、50%、75%，再次測定各稀釋組的桑葉多酚絕對量和含量。如表2所示，隨著稀釋程度的增加，桑葉多酚絕對量和含量逐漸降低，各稀釋組之間差異極顯著(P<0.01)。

表2 稀釋處理對桑葉多酚絕對量和含量的影響

2.3 各乙醇提取組在不同稀釋處理下的DPPH自由基清除率

如表3所示，將桑葉多酚提取液稀釋2、4、8、16倍后，各提取組的DPPH自由基清除率均隨稀釋水平的增加而降低；在60%乙醇提取組中，2倍稀釋組的DPPH自由基清除率極顯著高于其他各組(P<0.01)；4倍稀釋組的DPPH自由基清除率顯著高于8倍稀釋組(P<0.05)，極顯著高于16倍稀釋組(P<0.01)。

表3 各乙醇提取組在不同稀釋處理下的DPPH自由基清除率

在70%乙醇提取組中，2倍稀釋組的DPPH自由基清除率顯著高于16倍稀釋組(P<0.05)，4倍稀釋組的DPPH自由基清除率顯著高于16倍稀釋組(P<0.05)。

在80%乙醇提取組中，各稀釋組之間的DPPH自由基清除率差異均極顯著(P<0.01)。

2.4 桑葉多酚提取液的抗氧化能力評價

以Trolox溶液的各個質量濃度為橫坐標，與之對應的DPPH自由基清除率為縱坐標，繪制Trolox質量濃度-DPPH自由基清除率標準曲線(圖3)，經酶標儀檢測，標準曲線為Y=265.52X+11.639 (R2=0.994)。計算得到Trolox標準品的IC50=0.144 mg/mL。

圖3 Trolox質量濃度-DPPH自由基清除率標準曲線

如表4所示，60%乙醇提取組的IC50極顯著低于70%乙醇提取組(P<0.01)，顯著低于80%乙醇提取組(P<0.05)。與Trolox標準品相比，各乙醇提取組的IC50均相對較高，這說明雖然桑葉多酚提取液的抗氧化活性較Trolox標準品弱，但仍然具有一定的抗氧化能力。

表4 各乙醇提取組的IC50

通過對桑葉多酚絕對量與IC50之間的相關性分析，計算出桑葉多酚絕對量與IC50呈負相關，相關系數(r)=-0.474；即多酚絕對量越高，IC50越小，提取液的體外抗氧化能力越強；但相關關系不顯著(P>0.05)。通過曲線擬合的方式，構建起桑葉多酚絕對量(X)與IC50(Y)的擬合方程為：Y=-43.757X2+44.503X+11.263 (R2=0.314)。

3 討 論

3.1 桑葉多酚的提取工藝

本試驗采取超聲波輔助提取法，探究了乙醇濃度對桑葉多酚提取的影響。其中，超聲波輔助提取法是利用超聲波輻射壓強，使提取溶劑內所有的分子產生較為劇烈的物理效應，進而加速目標成分進入溶劑，提高目標成分的提取率。與傳統的醇提法相比，超聲波輔助提取法充分利用了超聲波的機械破碎作用和空化效應，加快了桑葉多酚向溶劑中擴散的速率，大大縮短了桑葉多酚的提取時間，超聲波輔助提取法的優勢在于提取效率較高，所使用的溶劑較少，提取溫度較低，成本較低，適宜于在生產中大批量的使用。而近年來興起的微波提取法則是讓植物細胞在微波的作用下，產生巨大的熱量，促進提取物從細胞中擴散出來，微波提取法的優勢在于效率較高且操作簡單，并能夠有效地保護多酚不受氧化，但缺點是設備比較昂貴且維修保養較為繁瑣[8-10]。楊上鶯等[11]采用超聲波輔助提取乙醇的方法提取桑葉多酚，確定濃度為60%的乙醇是最佳的溶劑，這與本試驗所得結論一致。初步推測濃度為60%的乙醇與桑葉中的多酚類物質極性可能是最為接近的，有利于這些活性物質的溶出，故而在此提取條件下多酚含量最高。祁偉亮等[12]亦采取了超聲波輔助提取法提取桑葉多酚，發現在乙醇濃度為30%、固液比為1∶35、提取時間為70 min、超聲波溫度為70 ℃的條件下桑葉多酚含量最高，并推測更低濃度的乙醇可能與桑葉多酚結構更加相似。這與本試驗的研究結果不同，其原因可能是：1)本試驗所采摘的桑葉品種與之不同，且采摘時間也存在差異，上述2個因素對桑葉多酚含量影響較大。2)桑葉多酚含量受到提取溫度、料液比、超聲提取時間、超聲波功率等多個因素共同作用，而本試驗只研究了乙醇濃度這一個因素的影響，沒有采取響應面法[13]對多個因素進行嚴格地控制并探究出桑葉多酚的最佳提取工藝，因此有必要在后續試驗中完善其他因素對桑葉多酚提取的影響。

3.2 桑葉多酚含量與DPPH自由基清除率之間的量效關系

3.3 桑葉多酚的體外抗氧化能力評價

植物多酚因能使未成對電子離域而激發其化學活性，能夠通過清除自由基、與金屬離子螯合、抑制體內多種氧化酶的活性而起到抗氧化作用[19]。且這種抗氧化作用在動物體內主要表現為提高其生產性能和提升機體抗氧化損傷的能力；在體外則表現為清除特定自由基的能力。曹蓉等[20]研究發現，厚樸總酚顯著提升了29～56日齡黃羽肉雞的平均日增重，并對改善其肉品質有一定的促進作用；此外，厚樸總酚還可顯著提高黃羽肉雞血清中過氧化氫酶(catalase，CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，降低肝臟中丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，因而增強了黃羽肉雞的抗氧化功能。王彥陽等[21]研究發現，腰果葉多酚提取物具有天然抗氧化活性，當其濃度為5 mg/L時，對DPPH自由基的清除率達62%，且較同濃度條件下的維生素C高；巫永華等[22]研究發現，山楂葉多酚在純化前后對清除DPPH自由基的IC50分別為1.28和0.78 μg/mL，體外抗氧化活性非常優越；謝佳函等[23]對紅豆皮多酚的抗氧化試驗結果表明，隨著濃度的增大，紅豆皮多酚粗提物、多酚純化物和維生素C對DPPH自由基的清除率呈先增加后平緩的趨勢，當濃度為150 μg/mL時，多酚純化物與維生素C對DPPH自由基的清除率大致相等，達96.53%，說明純化后的紅豆皮多酚對DPPH自由基的清除效果較維生素C弱。桑葉多酚作為眾多植物多酚中的一種，亦具有良好的體外抗氧化活性。本試驗發現，60%乙醇提取組中的桑葉多酚提取液對DPPH自由基的IC50最低，對DPPH自由基的清除效果最好，且該組對應的桑葉多酚含量最高；而70%乙醇提取組的桑葉多酚含量最低，對DPPH自由基的IC50最高，其對DPPH自由基的清除效果最弱；且根據桑葉多酚絕對量與IC50的相關性分析可知，兩者呈負相關，這一結論驗證了上述試驗結果的正確性，進一步反映出桑葉多酚含量與體外抗氧化能力之間的量效關系，初步推測桑葉多酚含量可以作為評價桑葉體外抗氧化能力的一項重要指標，這與沈維治等[14]的研究報道一致。

4 結 論

綜上所述，桑葉多酚作為桑葉中的一類重要的天然活性物質，具有良好的體外抗氧化作用。桑葉多酚含量與體外抗氧化能力之間存在一定的量效關系，雖然桑葉多酚提取液的體外抗氧化能力弱于Trolox標準品，但桑葉多酚仍然具有良好的體外抗氧化性能，可作為一種潛在的抗氧化添加劑被應用于飼料生產與加工領域。