甘草酸單銨鹽對體外瘤胃發酵參數及甲烷產量的影響

蔣辰宇 崔浩然 白天天 普宣宣 劉俊峰，2 郭雪峰，2*

(1.塔里木大學動物科學學院，阿拉爾843300；2.畜牧科技兵團重點實驗室，阿拉爾843300)

在過去25年中，隨著人們對畜產品需求量的增加，加速了畜牧業的發展，導致反芻動物數量增多和溫室氣體排放量增加。甲烷排放量僅次于二氧化碳，但它在地球上的升溫潛能約為二氧化碳的25倍[1]。其他研究表明，反芻動物的甲烷排放不僅造成2%～12%的能量損失，而且降低了飼料利用率并導致動物生產性能的降低和飼養成本增加[2]。因此，降低反芻動物的甲烷排放量不僅減少對環境的污染，并且還提高了反芻動物生產性能，減少飼料能量損失。有研究表明，皂苷作為植物次生代謝產物可以提高瘤胃發酵效率[3]，通過直接或間接抑制產甲烷菌的活性，降低甲烷產生，此外，它還能提高菌體蛋白的合成效率，提高流入十二指腸的菌體蛋白產量[4]。皂苷是苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的一類糖苷，源于不同植物提取的皂苷在改善瘤胃發酵方式及效果上也不盡相同[5-8]。甘草酸單銨鹽是甘草皂苷(又稱甘草酸)的一種鹽形式。甘草酸單銨鹽的分子式為C42H65NO16，甘草皂苷的分子式為C42H62O16。由于甘草皂苷在常溫中水溶性較低，為獲得穩定、安全、方便的使用途徑，通常使用水溶性較好的甘草酸鹽，如甘草酸單銨鹽、甘草酸二銨鹽、甘草酸一鉀鹽等[9]。新疆是中國甘草的主要產區，具有非常豐富的甘草資源，若甘草酸單銨鹽能夠用于調控反芻動物瘤胃發酵，降低瘤胃甲烷產量，可為新疆地區豐富的甘草資源開發利用提供新的思路。因此，本試驗研究不同濃度的甘草酸單銨鹽對綿羊體外瘤胃發酵參數及甲烷產量的影響，旨在為其作為植物提取物添加劑的應用提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘草酸單銨鹽選購自新疆阿拉爾某甘草產業有限責任公司，為白色粉末，高效液相色譜法(HPLC)測定其純度≥98%。

1.2 試驗動物及飼糧

選取3只平均體重為(35±3) kg、安裝永久性瘺管的卡拉庫爾羊作為瘤胃液采集的試驗動物。每日09:00和20:00分2次定量飼喂，自由飲水。根據《肉羊飼養標準》(NY/T 816—2004)[10]進行飼糧配制，飼糧以玉米和苜蓿顆粒為主要原料，精粗比為60:40，其組成及營養水平見表1。

表1 飼糧組成及營養水平(風干基礎)

續表1項目 Items含量 Content消化能 DE/(MJ/kg)13.61粗蛋白質 CP11.35鈣 Ca1.14磷 P0.32非纖維性碳水化合物 NFC3)56.11中性洗滌纖維 NDF34.85非纖維性碳水化合物/中性洗滌纖維 NFC/NDF1.61

1.3 試驗設計

體外培養以粉碎過40目后的基礎飼糧為發酵底物，分別設置對照組、Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組，甘草酸單銨鹽添加濃度分別為0、50、150、250、350、450 mg/L的，分別進行3、9、12、21、24 h的分批次體外培養，每個濃度的每個時間設置3個重復，測定其pH、總產氣量、干物質降解率、氨態氮(NH3-N)濃度、揮發性脂肪酸(VFA)濃度及甲烷產量。

1.4 體外發酵培養方法

1.4.1 體外發酵裝置

體外發酵裝置為恒溫水浴搖床(溫度和搖晃頻率均可調節)，搖床上安裝自制框架，用于固定玻璃注射器(100 mL)，并使玻璃注射器的2/3浸入水浴中。玻璃注射器底端連接有自制可控制開關的閥門，用于抽取人工瘤胃液和收集發酵氣體。

1.4.2 人工瘤胃液配置

瘤胃液采集：晨飼前2 h，采集3只綿羊瘤胃中不同位點的瘤胃液，并用40～60目4層尼龍布過濾，隨后倒入預熱達39 ℃的保溫瓶中，蓋嚴瓶口，迅速帶回實驗室并保溫備用。

人工瘤胃液制備：人工唾液根據Menke等[11]的方法制備。備齊所需培養液，并按1∶2的比例向瘤胃液中加入提前通入二氧化碳并預熱的人工唾液均勻混合，此過程持續通入二氧化碳。

1.4.3 體外發酵培養及樣品的處理

準確稱取發酵底物0.2 g及對應濃度的甘草酸單銨鹽，將其放入注射器頂端，每個樣品稱取3個平行樣。注射芯在插入注射器前應在其表面均勻涂抹凡士林，并小心插入注射器，防止發酵底物被吹出。將配制完的人工瘤胃液吸至注射器內，此過程持續通入二氧化碳，每支30 mL，關閉注射器閥門，置于39 ℃恒溫數顯水浴搖床中振蕩發酵。記錄不同發酵時間點的產氣量，氣體通過采血針及真空采血管進行收集，收集的氣體用于測定甲烷產量，收集氣體后的發酵液立即進行pH測定，隨后將發酵液3 500 r/min離心10 min。取發酵液上清液分裝入瓶，-20 ℃保存，用于測定NH3-N和VFA濃度。

1.5 指標測定

總產氣量：通過讀取注射器上的刻度測定。

pH：通過希瑪牌便攜式pH測試筆進行測定。

干物質降解率：按照《動物營養與飼料科學實踐教程》[12]測定飼糧干物質含量并按公式計算降解率。

歐陽橘紅調離濱湖先到南京，偶然的機會認識了部里一個司長，半年不到就結了婚，婚后就沒回南京上班了。她先在化工部當工程師，那年國務院組建石油化工集團公司，從化工部分了一批人到集團公司，她也分到了集團公司，最后在集團副總工程師的位置退休，現在還兼了兩所大學客座教授。

干物質降解率=100×(B-C)/B。

式中：B為待測樣品中干物質的含量；C為待測樣品尼龍袋殘渣中干物質含量。

NH3-N濃度：參照馮宗慈等[13]方法進行測定。

VFA濃度：參照丁學智等[14]的方法，采用GC-2014氣相色譜儀進行測定。測定條件為進樣口溫度130 ℃，檢測器溫度200 ℃，柱溫220 ℃，柱流量0.6 mL/min。

甲烷產量：采用GC-2014氣相色譜儀測定。測定條件為進樣口溫度120 ℃，檢測器溫度180 ℃，柱溫80 ℃，柱流量1 mL/min。

1.6 數據處理

數據用SPSS 21.0的單因素方差分析進行顯著性分析，用Duncan氏法和LSD法進行多重比較，以平均值±標準差表示結果。P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同濃度甘草酸單銨鹽對體外累積產氣量的影響

由表2可知，隨著發酵時間的增長，產氣量逐漸增加，其中發酵初期產氣量增長速度較快，且添加甘草酸單銨鹽后的產氣量增長速度高于對照組。但在發酵24 h后，Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組的產氣量均顯著低于對照組(P<0.05)。Ⅰ組和Ⅱ組在發酵24 h后的產氣量略大于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。發酵24 h后產氣量最低組為Ⅴ組，產氣量為47.93 mL；產氣量最高組為Ⅱ組，產氣量為64.83 mL。

表2 不同濃度甘草酸單銨鹽對體外產氣量的影響

2.2 不同濃度甘草酸單銨鹽對發酵液pH的影響

由表3可知，隨著發酵時間的增長,各組pH呈逐漸下降的趨勢。不同濃度的甘草酸單銨鹽處理后，各試驗組pH均有所下降。在發酵3 h后，各試驗組pH均顯著低于對照組(P<0.05)；發酵9 h后，Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組的pH顯著低于對照組(P<0.05)，其他試驗組與對照組相比差異不顯著(P>0.05)；發酵12 h后，各試驗組pH均低于對照組，其中Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組與對照組相比差異顯著(P<0.05)；在發酵21 h后，各試驗組pH均顯著低于對照組(P<0.05)；但發酵24 h后，各試驗組與對照組相比，差異均不顯著(P>0.05)。

表3 不同濃度甘草酸單銨鹽對發酵液pH的影響

2.3 不同濃度甘草酸單銨鹽對發酵底物干物質降解率的影響

表4 不同濃度甘草酸單銨鹽對發酵底物干物質降解率的影響

2.4 不同濃度甘草酸單銨鹽對發酵液NH3-N濃度的影響

由表5可知，與對照組相比，各試驗組的NH3-N濃度有下降的趨勢。在發酵3 h后，Ⅰ組、Ⅳ組、Ⅴ組的NH3-N濃度均顯著低于對照組(P<0.05)；在發酵9 h后，Ⅲ組、Ⅳ組的NH3-N濃度顯著低于對照組(P<0.05)；在發酵12 h后，Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組的NH3-N濃度均顯著低于對照組(P<0.05)；在發酵21 h后，Ⅳ組的NH3-N濃度顯著低于對照組(P<0.05)；在發酵24 h后，Ⅱ組和Ⅴ組的NH3-N濃度顯著低于對照組(P<0.05)。

表5 不同濃度甘草酸單銨鹽對瘤胃液NH3-N濃度的影響

2.5 不同濃度甘草酸單銨鹽對發酵液VFA濃度的影響

由表6可知，隨著發酵時間的增長，添加甘草酸單銨鹽發酵液的VFA濃度均呈逐漸增加后稍有降低的趨勢。與對照組相比，試驗組乙酸濃度均呈降低的趨勢，在發酵12 h后，Ⅲ組乙酸濃度顯著低于對照組(P<0.05)；在發酵3、9和12 h后,Ⅳ組乙酸濃度顯著低于對照組(P<0.05)；在發酵3和12 h后，Ⅴ組乙酸濃度顯著低于對照組(P<0.05)。Ⅰ組再發酵12 h后，Ⅲ組在發酵12 h后，Ⅳ組在發酵3、9和12 h后，Ⅴ組在發酵3和12 h后丙酸濃度均顯著低于對照組(P<0.05)，但在發酵24 h后，各試驗組丙酸濃度與對照組相比，差異不顯著(P>0.05)。Ⅳ組在發酵3和9 h后，及Ⅴ組在發酵3、12及21 h后，丁酸濃度均顯著低于對照組(P<0.05)，在發酵24 h后，Ⅳ組的丁酸濃度最低，但與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。乙酸/丙酸隨著甘草酸單銨鹽濃度的增加逐漸降低。

表6 不同濃度甘草酸單銨鹽對瘤胃液VFA濃度的影響

2.6 不同濃度甘草酸單銨鹽對發酵液甲烷產量的影響

由表7可知，隨著各組發酵時間的增加，甲烷產量也隨之增加，但甲烷產量隨著甘草酸單銨鹽濃度的增加而逐漸降低。在發酵9 h后，Ⅳ組的甲烷產量顯著低于對照組(P<0.05)，其他試驗組均與對照組相比差異不顯著(P>0.05)；在發酵3、12、21、24 h后，各試驗組與對照組相比差異均不顯著(P>0.05)。

表7 不同濃度甘草酸單銨鹽對發酵液甲烷產量的影響

3 討 論

瘤胃產氣量在一定程度上可以反映出發酵底物被瘤胃微生物利用的程度[15]，同時產氣量也能夠表現出飼糧中可以利用營養成分的多少，當可利用的營養成分越高時產氣量越高[16]。瘤胃氣體主要來源于瘤胃中碳水化合物發酵所產生的氣體，主要成分是二氧化碳(50%～65%)、甲烷(30%～40%)，其中還有少量的氮氣、氧氣、氫氣和硫化氫[17]。Hu等[18]利用不同濃度的茶皂素體外發酵24 h，結果表明添加茶皂素減少了瘤胃的產氣量；郭雪峰等[5]利用甘草提取物進行體外發酵24 h，結果表明產氣量隨著甘草提取物濃度的增加而降低，與本試驗結果一致。但王曉霞等[6]的研究發現，通過體外發酵試驗研究無患子皂苷及茶皂素對瘤胃發酵及甲烷產量的影響，表明添加無患子皂苷及茶皂素均提高了瘤胃產氣量并且降低了甲烷產量。牛俊麗等[7]的研究也表明絲蘭皂苷提高了瘤胃產氣量同時降低了甲烷產量。王新峰[8]在體外發酵試驗中添加絞股藍皂苷減少了產氣量同時也減少了甲烷產量。不同植物皂苷均對瘤胃甲烷的產量起到抑制的作用，但產氣量的高低有所不同，這可能是由于不同植物皂苷的分子結構不同，導致對改善瘤胃發酵途徑有所不同，其原理有待進一步研究。

pH是反映瘤胃穩定性的重要指標。飼糧結構是影響瘤胃pH的主要因素，pH過高或過低對瘤胃微生物的生長和繁殖都會產生影響[19]。瘤胃發酵的pH正常范圍一般在6.0～7.0。同時pH的變化會影響VFA濃度以及VFA組成[20]。本試驗參考史高峰等[21]的方法測定甘草酸單銨鹽呈弱酸性，可能影響到本試驗各組的pH，使其有降低的趨勢，但各組pH(6.09～6.40)始終處于6.0～7.0的正常范圍之內，對瘤胃微生物的正常活動沒有產生負面影響。

飼糧底物降解率在一定程度上反映瘤胃微生物對其利用的情況，同時降解率的高低與飼糧營養組成有著密不可分的關系[22]。潘龍等[23]的研究表明，添加柴胡皂苷提高了飼糧干物質降解率，這與本試驗添加350 mg/L的甘草酸單銨鹽提高了干物質降解率結果一致。也有研究表明，添加低濃度的絲蘭皂苷可刺激某些瘤胃細菌的生長，調節微生物群落結構，從而提高了飼糧消化率，但高濃度的皂苷在改善瘤胃發酵上起到驅除原蟲類似的特性，會導致飼糧消化率下降[24]。但徐晨晨等[25]的研究表明，添加苜蓿皂苷對飼糧干物質降解率無顯著影響。因此，關于皂苷對飼糧降解率的影響結果報道不一致，這可能與皂苷的種類和添加劑量有關，具體作用機制有待進一步研究。

NH3-N是飼糧中蛋白質在瘤胃內發酵分解的產物，也是瘤胃微生物合成菌體蛋白的主要成分，其濃度反映瘤胃微生物對飼糧中蛋白質分解能力及吸收速率的平衡狀態[26]。在瘤胃中的大部分細菌都是以NH3-N為生長的唯一氮源，而瘤胃原蟲不能利用NH3-N合成所需的蛋白質，但可以產生大量NH3-N[27]。嚴淑紅[28]報道奶牛灌服茶皂素可降低NH3-N濃度，其原因可能是茶皂素抑制了原蟲的活性，本試驗結果與其相似，隨著甘草酸單銨鹽濃度的增加，發酵液的NH3-N的濃度逐漸降低。但有其他研究表明添加絞股藍皂苷使NH3-N濃度增加，其原因可能是絞股藍皂苷導致原蟲裂解，產生大量微生物蛋白并被其他微生物所利用，從而導致NH3-N濃度的增加[8]。本試驗各試驗組的NH3-N濃度均在6～30 mg/dL的正常范圍之內，因此添加甘草酸單銨鹽未對發酵液NH3-N的平衡性產生不利影響。

VFA可為反芻動物提供能量，是動物生長、繁殖與泌乳等基本活動的主要能量來源之一，其濃度變化直接影響反芻動物對營養物質的吸收、利用和生產能力等[29]。其中瘤胃微生物是影響VFA比例和利用率的主要因素。纖維降解菌利用飼糧中碳水化合物生成乙酸、甲酸、H2、乙醇和乳酸，同時瘤胃甲烷菌與其存在共生關系可以利用種間氫轉移跳過降解過程中生成丙酸和琥珀酸等步驟，提高能量轉化效率以及飼料利用率[30]。有研究表明，甲烷產量與纖維的降解率呈正相關，且反芻動物瘤胃中產甲烷菌的數量和纖維降解菌的數量也呈正相關關系[31]。本試驗在添加甘草酸單銨鹽后乙酸在發酵后期濃度有所降低，致使乙酸/丙酸下降，導致甲烷產量降低，與上述報道一致。張婷婷[32]研究報道，茶皂甙主要通過改變瘤胃VFA組成結構來調控瘤胃發酵模式，且改善瘤胃發酵的主要原因是降低了乙酸/丙酸，這與本試驗的結果一致。但王勇等[33]報道稱，在飼糧中添加苜蓿皂苷提取物提高了乙酸和丁酸的濃度，降低了丙酸濃度，改善了瘤胃發酵模式并提高了采食量及日增重。關于皂苷對瘤胃VFA組成影響的報道不一致，這可能與皂苷的種類及理化性質有關。也有研究報道認為瘤胃pH對VFA的結構也有影響，當pH在5.5時添加絲蘭提取物改變了VFA結構，提高了丙酸濃度，降低了乙酸濃度，但pH在7.0時則對VFA結構無影響[34]。本試驗添加甘草酸單銨鹽發酵液的pH為6.09～6.40，可能會引起VFA結構的改變，但機理需要進一步研究。

影響甲烷產量的因素有很多，如飼糧營養結構、pH、乙酸/丙酸、瘤胃甲烷菌數量等[35]。反芻動物甲烷排放量其中90%是由瘤胃微生物甲烷菌產生[36]。本試驗結果表明，隨著甘草酸單銨鹽濃度的提高，甲烷產量逐漸降低，說明甘草酸單銨鹽對瘤胃甲烷的產生存在抑制作用，但同時瘤胃pH、NH3-N、VFA濃度等指標均在正常的范圍內，說明甘草酸單銨鹽在抑制甲烷產生的同時并未對瘤胃發酵產生負面影響。Rodríguez等[37]以狼尾草作為發酵底物，添加象耳豆皂苷體外發酵24 h并測定甲烷產量，結果表明甲烷產量顯著降低。有研究認為絲蘭皂苷、絞股藍皂苷、絲蘭皂苷等均可降低瘤胃甲烷的產生量[5-8]，但降低瘤胃甲烷產生量的途徑并不相同。有研究表明，皂苷可導致瘤胃原蟲的數量減少，從而導致生成甲烷需要的H2減少，與原蟲共生的甲烷菌數量降低[38]。但由于不同種類的皂苷在改善瘤胃發酵途徑上有所不同，影響甲烷產量的機理可能也有所不同，因此甘草酸單銨鹽抑制甲烷產生的微生物機理有待進一步通過體內試驗進行研究。

4 結 論

① 甘草酸單銨鹽可降低瘤胃液體外發酵的產氣量、pH、NH3-N濃度、乙酸/丙酸、甲烷產量，但均未超過正常的生理范圍。

② 在本試驗條件下，通過各項指標分析比較，綜合認為添加濃度為350 mg/L的甘草酸單銨鹽適宜綿羊體外發酵。