不同類型酒糟瘤胃發(fā)酵特性和甲烷產(chǎn)量的比較

代秦丹 王之盛 胡 瑞 周芯宇 祝伊梟 汪 成 王雪瑩 鄒華圍 師俊華 彭全輝 薛 白 王立志

(四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，四川省牛低碳養(yǎng)殖與安全生產(chǎn)高校重點實驗室，成都611130)

酒糟是釀酒加工的副產(chǎn)物，產(chǎn)量巨大，2019年我國僅白酒糟的產(chǎn)量就達2 115萬t[1]。釀酒是一個多菌協(xié)同作用的過程，此過程中大量營養(yǎng)成分被轉(zhuǎn)化利用。與常規(guī)飼料不同，經(jīng)釀酒過程后，雖然酒糟中仍含有相當多的未利用的蛋白質(zhì)、淀粉等營養(yǎng)成分，但難以降解的致密纖維結(jié)構(gòu)比例也相應(yīng)增加[2]。導致酒糟在單胃動物中的利用受到限制，而在反芻動物飼糧中，酒糟可作為一種優(yōu)質(zhì)低成本飼料資源。飼糧中添加一定比例的酒糟能改善肉牛的生長性能，節(jié)約飼料成本[3]。我國酒種類眾多，不同種類酒的釀造原料及釀造工藝相差較大，導致酒糟難溶性碳水化合物以及微生物代謝產(chǎn)物種類和比例也有區(qū)別。研究發(fā)現(xiàn)相同類型酒糟營養(yǎng)組成差異較小，而不同類型酒糟營養(yǎng)組成差異較大[4-5]，但反芻動物瘤胃對不同類型酒糟的利用效果還尚不明確。

利用體內(nèi)法評定飼料的發(fā)酵特性和甲烷(CH4)產(chǎn)量需要大量飼料原料，費時費力，成本高，且一般不適用于單一飼料。與之相比，體外法成本相對較低，發(fā)酵結(jié)果與體內(nèi)法有高度相關(guān)性[6]，目前廣泛應(yīng)用于飼料資源的評估。反芻動物瘤胃微生物可利用飼糧中碳水化合物生成氨態(tài)氮(NH3-N)、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)和微生物蛋白(MCP)，同時還伴隨著CH4及二氧化碳(CO2)等氣體產(chǎn)生。CH4是重要的溫室氣體，據(jù)估計，全球反芻動物瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的CH4排放量占人類活動產(chǎn)生的20%～25%[7]，而反芻動物自身以甲烷能形式損失的能量占飼料總能的5%～12%[8]。但不同類型酒糟的CH4排放情況還鮮有報道，目前大多研究是針對某一類型酒糟，如孟杰等[9]體外試驗發(fā)現(xiàn)白酒糟的CH4產(chǎn)量低于玉米秸稈和大豆秸稈，而對不同類型酒糟瘤胃發(fā)酵特性以及CH4產(chǎn)量還有待研究。因此，本試驗利用體外產(chǎn)氣技術(shù)探索不同類型酒糟在瘤胃中的瘤胃發(fā)酵特性和CH4產(chǎn)量，并在此基礎(chǔ)上分析不同酒糟營養(yǎng)成分與CH4產(chǎn)量和VFA濃度的相關(guān)性，為我國肉牛養(yǎng)殖生產(chǎn)實踐中科學使用酒糟飼料提供試驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗采集醬香型發(fā)酵酒糟(MFDG)、醬香型酒糟(MDG)、濃香型酒糟(LDG)、青稞糟(HBG)、玉米酒精糟(DDGS)、啤酒糟(BDG)6種酒糟各500 g，于65 ℃條件下烘干，一部分粉碎過40目篩用于營養(yǎng)成分測定，一部分過18目篩用于體外發(fā)酵試驗。

1.2 試驗處理

利用體外產(chǎn)氣技術(shù)，評定濃香型酒糟、醬香型酒糟、青稞糟、醬香型發(fā)酵酒糟、玉米酒精糟和啤酒糟在體外發(fā)酵24、48和72 h后瘤胃發(fā)酵特性和CH4產(chǎn)量的差異，每種酒糟在發(fā)酵24、48和72 h時間點各設(shè)5個重復，并記錄2、4、6、9、12、24、36、48、72 h時發(fā)酵管刻度讀數(shù)。

1.3 瘤胃液采集

瘤胃液于晨飼前2 h，以口腔插管的方法取自2歲健康的3頭荷斯坦奶公牛[體重(627.83±20.05) kg]，瘤胃液經(jīng)4層無菌紗布過濾到充滿CO2的保溫瓶中，并迅速送回實驗室。奶公牛飼養(yǎng)于四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)所試驗基地。

1.4 體外發(fā)酵試驗

參照Menke等[10]方法配制人工唾液，進行體外發(fā)酵。稱取300 mg發(fā)酵底物于100 mL密封性良好的透明玻璃發(fā)酵管底部，試驗另設(shè)3個未添加任何底物的空白對照，用于矯正累積產(chǎn)氣量(GP)。管塞下部2/3處均勻涂抹凡士林，塞進外管30 mL刻度線處，注射口連接約6 cm的橡膠管。采集的瘤胃液與人工唾液按1∶2混合為發(fā)酵液，每個發(fā)酵管注入30 mL發(fā)酵液，排出管內(nèi)多余空氣，夾好夾子，即記錄初始刻度。在(39.0±0.5) ℃恒溫振蕩水浴鍋中分別進行24、48和72 h體外發(fā)酵試驗。各時間段發(fā)酵結(jié)束后，記錄發(fā)酵管刻度，然后用鋁箔集氣袋收集氣體，待測CH4、氫氣(H2)和CO2含量。最后將發(fā)酵管置于冰水中終止發(fā)酵，發(fā)酵液分裝于10 mL無菌離心管中，72 h發(fā)酵結(jié)束后測發(fā)酵液pH，其余-20 ℃保存，用于NH3-N、VFA濃度和MCP含量的測定。

1.5 指標測定與分析

1.5.1 酒糟營養(yǎng)成分測定

干物質(zhì)(DM)、粗灰分(Ash)和粗蛋白質(zhì)(CP)含量分別按照GB/T 6435—1986、GB/T 6438—2007和GB/T 6432—1994測定；參照Van Soest等[11]方法測定樣品中的中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量；中性洗滌可溶物(NDS)=100-NDF；總能(GE)使用氧彈式熱量計(PARR-1281型)測定。

1.5.2 GP和產(chǎn)氣動力學參數(shù)的計算

GP的計算公式[12]如下：

GPt=200×(Vt-V0)/W。

式中：GPt為t時間點的累積產(chǎn)氣量(mL/mg)；Vt為樣品發(fā)酵t小時后培養(yǎng)管刻度讀數(shù)；V0為樣品在開始培養(yǎng)時空白培養(yǎng)管刻度讀數(shù)；W為樣品干物質(zhì)重量(mg)。

參照指數(shù)模型對不同酒糟的GP進行非線性回歸擬合[13]:

GPt=B×[1-e-c×(t-lag)]。

式中：GPt為t時間點的累積產(chǎn)氣量(mL/mg)；B為理論最大產(chǎn)氣量(mL/mg)；c為產(chǎn)氣速度(%/h)；t為培養(yǎng)時間(h)；lag為產(chǎn)氣延滯時間(h)。

1.5.3 瘤胃發(fā)酵參數(shù)測定

參照Khorasani等[14]方法對發(fā)酵液進行處理，使用氣相色譜儀(CP-3800)測定乙酸、丙酸和丁酸濃度，總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度為乙酸、丙酸和丁酸濃度之和。發(fā)酵液pH采用雷磁25型pH酸度計測定。參照Broderick等[15]的比色法測定NH3-N濃度。參照王曉光[16]的差速離心法提取MCP沉淀，稀釋后使用南京建成生物工程研究所BCA蛋白定量測試盒測定MCP含量。

1.5.4 氣體成分含量測定

采用氣相色譜儀(福立GC9790Ⅱ)測定氣體中CH4、H2和CO2的百分含量。測定條件為載氣：氬氣，氣體流量：20 mL/min，進樣量：0.5 mL；TCD檢測器，柱子型號：TDX-01(1 m×1/8)，柱箱：80 ℃，檢測器溫度：120 ℃，進樣口溫度：120 ℃。

氣體產(chǎn)量=GPt×百分含量。

式中：氣體產(chǎn)量為單位發(fā)酵底物的CH4、CO2或H2產(chǎn)量(mL/mg)；GPt為樣品在t時刻的累積產(chǎn)氣量(mL/mg)；百分含量是發(fā)酵產(chǎn)生的總氣體中CH4、CO2或H2百分比例測定值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2018整理后，用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行one-way ANOVA并以Duncan氏法進行多重比較，結(jié)果以平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著。對發(fā)酵特性和營養(yǎng)成分之間進行Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酒糟的營養(yǎng)成分

由表1可知，不同類型酒糟CP含量為15.20%～30.71%。玉米酒精糟CP含量顯著高于其他酒糟(P<0.05)，濃香型酒糟CP含量顯著低于其他酒糟(P<0.05)。濃香型酒糟NDF、ADF以及Ash含量顯著高于其他酒糟(P<0.05)。玉米酒精糟NDF和ADF含量顯著低于其他酒糟(P<0.05)，而NDS含量顯著高于其他酒糟(P<0.05)。啤酒糟GE顯著高于其他酒糟(P<0.05)。

表1 不同酒糟的營養(yǎng)成分(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2.2 不同酒糟的GP及產(chǎn)氣動力學參數(shù)

由圖1可知，隨著發(fā)酵時間推移，不同類型酒糟GP都呈增加的趨勢，在4～6 h的GP均迅速增加，發(fā)酵9 h后青稞糟和玉米酒精糟GP均高于其他酒糟，發(fā)酵效果好。由表2可知，發(fā)酵48和72 h，青稞糟和玉米酒精糟GP、理論最大產(chǎn)氣量顯著高于其他酒糟(P<0.05)，而醬香型發(fā)酵酒糟GP顯著低于其他酒糟(P<0.05)。玉米酒精糟產(chǎn)氣速率顯著低于其他酒糟(P<0.05)。啤酒糟產(chǎn)氣延滯時間顯著高于其他酒糟(P<0.05)，玉米酒精糟產(chǎn)氣延滯時間顯著低于其他酒糟(P<0.05)。

圖1 不同類型酒糟GP的動態(tài)變化

表2 不同類型酒糟發(fā)酵24、48和72 h GP以及72 h產(chǎn)氣動力學參數(shù)

2.3 不同類型酒糟發(fā)酵的TVFA和VFA比例

由表3可知，發(fā)酵24和72 h，青稞糟TVFA濃度顯著高于其他酒糟(P<0.05)。發(fā)酵24和48 h，青稞糟和玉米酒精糟乙酸/TVFA顯著低于其他酒糟(P<0.05)，發(fā)酵48 h，啤酒糟乙酸/TVFA顯著高于其他酒糟(P<0.05)。發(fā)酵48和72 h，青稞糟和玉米酒精糟丙酸/TVFA顯著高于其他酒糟(P<0.05)。發(fā)酵24 h，青稞糟丁酸/TVFA顯著低于其他酒糟(P<0.05)；發(fā)酵48 h，醬香型發(fā)酵酒糟丁酸/TVFA顯著高于其他酒糟(P<0.05)；發(fā)酵72 h，啤酒糟丁酸/TVFA顯著低于其他酒糟(P<0.05)。發(fā)酵48和72 h，青稞糟和玉米酒精糟乙酸/丙酸顯著低于其他酒糟(P<0.05)。

表3 不同酒糟發(fā)酵24、48和72 h的VFA比例

2.4 不同類型酒糟的NH3-N濃度和MCP含量

由表4可知，不同酒糟發(fā)酵液pH在6.60～6.80。發(fā)酵48和72 h，啤酒糟和青稞糟NH3-N濃度顯著高于其他酒糟(P<0.05)；發(fā)酵24 h，青稞糟MCP含量顯著高于其他酒糟(P<0.05)，啤酒糟MCP含量顯著低于其他酒糟(P<0.05)；發(fā)酵72 h，玉米酒精糟MCP含量顯著高于其他酒糟(P<0.05)。

表4 不同類型酒糟發(fā)酵24、48和72 h的NH3-N濃度和MCP含量

2.5 不同類型酒糟的H2、CH4和CO2產(chǎn)量

由表5可知，發(fā)酵24和48 h，青稞糟和玉米酒精糟H2產(chǎn)量顯著高于其他酒糟(P<0.05)，發(fā)酵72 h，玉米酒精糟H2產(chǎn)量顯著高于其他酒糟(P<0.05)。發(fā)酵24 h，醬香型酒糟CH4產(chǎn)量顯著高于其他酒糟(P<0.05)；發(fā)酵72 h，醬香型發(fā)酵酒糟和濃香型酒糟CH4產(chǎn)量顯著低于其他酒糟(P<0.05)。發(fā)酵24 h，醬香型發(fā)酵酒糟CO2產(chǎn)量顯著低于其他酒糟(P<0.05)；發(fā)酵48和72 h，青稞糟和玉米酒精糟CO2產(chǎn)量顯著高于其他酒糟(P<0.05)。

表5 不同類型酒糟發(fā)酵24、48和72 h的H2、CH4和CO2產(chǎn)量

2.6 不同類型酒糟營養(yǎng)成分與發(fā)酵72 h VFA比例和CH4產(chǎn)量的相關(guān)性分析

由表6可知，CP、NDS含量和(NDS-Ash)/CP均與丙酸/TVFA和CH4產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與丁酸/TVFA呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。NDS含量和(NDS-Ash)/CP與TVFA濃度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。NDF和ADF含量均與丁酸/TVFA呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與TVFA濃度、丙酸/TVFA和CH4產(chǎn)量呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。

表6 營養(yǎng)成分與發(fā)酵72 h VFA比例和CH4產(chǎn)量的相關(guān)性分析

3 討 論

3.1 不同類型酒糟72 h GP及產(chǎn)氣動力學參數(shù)

不同類型酒糟作為發(fā)酵底物，GP具有明顯差異。GP在某種程度上可反映瘤胃微生物的降解活性和飼料降解率[17]，通常情況下，含結(jié)構(gòu)性碳水化合物較多的粗飼料GP最高峰在48 h以后出現(xiàn)[18]。青稞糟和玉米酒精糟發(fā)酵9～72 h GP高于其他酒糟，說明青稞糟和玉米酒精糟含有較多的可發(fā)酵成分和易發(fā)酵碳水化合物。本試驗濃香型酒糟、醬香型酒糟和醬香型發(fā)酵酒糟因含有大量稻殼，難降解碳水化合物含量高，GP低于其他酒糟。產(chǎn)氣動力學參數(shù)可以間接反映飼料在瘤胃中的消化情況，有研究發(fā)現(xiàn)理論最大產(chǎn)氣量與NDF消化性呈正相關(guān)[19]。而本試驗中NDF含量較低的青稞糟和玉米酒精糟理論最大產(chǎn)氣量較高，可能原因是其可消化降解性較高。產(chǎn)氣延滯時間可以代表飼料在體內(nèi)利用的難易程度，延滯時間越長，利用越慢[20]。本試驗中，啤酒糟產(chǎn)氣延滯時間高于其他酒糟，玉米酒精糟則與之相反，表明玉米酒精糟與其他酒糟相比，在體內(nèi)更容易被利用。而啤酒糟可能是因為其蛋白質(zhì)品質(zhì)較差，蛋白質(zhì)消化吸收率較低[21]，導致延滯時間最高。

3.2 不同類型酒糟24、48和72 h的發(fā)酵參數(shù)及CH4產(chǎn)量

瘤胃pH是衡量瘤胃發(fā)酵狀況的重要指標，一般為6～7[22]，本研究結(jié)果均在此范圍內(nèi)。飼料組成不同，VFA含量和比例也會有差異。6種酒糟中，發(fā)酵48和72 h青稞糟TVFA濃度最高，其次是玉米酒精糟和啤酒糟，醬香型發(fā)酵酒糟最低，提示青稞糟、玉米酒精糟和啤酒糟在為反芻動物供能上可能優(yōu)于其他酒糟，而醬香型發(fā)酵酒糟最差。根據(jù)乙酸/丙酸可知，啤酒糟、青稞糟和玉米酒精糟為偏丙酸型發(fā)酵，醬香型發(fā)酵酒糟、醬香型酒糟和濃香型酒糟為偏乙酸型發(fā)酵。NH3-N濃度能間接反映瘤胃微生物分解飼料CP產(chǎn)生NH3-N和利用NH3-N合成MCP的平衡情況[23]。瘤胃NH3-N濃度一般為6～30 mg/dL[24]，考慮到體外發(fā)酵過程中產(chǎn)生的NH3-N不能經(jīng)瘤胃上皮吸收，所以發(fā)酵72 h出現(xiàn)啤酒糟和青稞糟NH3-N濃度略超出范圍的現(xiàn)象。MCP是反芻動物最主要的蛋白質(zhì)來源，能提供反芻動物所需氨基酸的50%以上[25]，此外，MCP含量高低還可反映培養(yǎng)體系中微生物種群的數(shù)量、活力及其利用NH3-N的能力[26]。青稞糟和玉米酒精糟NH3-N含量較高，表明青稞糟和玉米酒精糟作為發(fā)酵底物時，其發(fā)酵液中微生物數(shù)量和活力高于其他酒糟。用生物發(fā)酵來改善低質(zhì)粗飼料營養(yǎng)價值是目前備受推崇的方法，其中醬香型發(fā)酵酒糟經(jīng)微生物固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生了MCP，所以與醬香型酒糟相比，CP含量增加。雖然醬香型發(fā)酵酒糟在供能方面較差，但發(fā)酵24和48 h NH3-N濃度高于醬香型酒糟和濃香型酒糟，MCP含量高于濃香型酒糟和啤酒糟，說明醬香型發(fā)酵酒糟在反芻提供動物蛋白質(zhì)方面具有一定的潛力。

對于反芻動物來說，CH4不僅會造成環(huán)境的污染，還會降低飼料能量的利用[27]。瘤胃發(fā)酵的最初階段主要以CO2-H2還原生成CH4途徑為主[28]，H2是生成CH4的主要前體物質(zhì)，發(fā)酵48和72 h，青稞糟和玉米酒精糟CH4產(chǎn)量高于其他酒糟，一方面可能是其H2和CO2產(chǎn)量較高，促進CH4的產(chǎn)生，另一方面可能是其更有助于甲烷菌的生長[29]。這暗示青稞糟和玉米酒精糟在反芻動物上飼喂時，以甲烷能損失的能量可能高于其他酒糟，易造成能量的浪費，且不利于減排。

3.3 不同類型酒糟營養(yǎng)成分與VFA比例和CH4產(chǎn)量的相關(guān)性分析

纖維成分是影響CH4產(chǎn)量的一個主要方面，CH4產(chǎn)生主要源于纖維物質(zhì)的降解[30]。而本試驗結(jié)果NDF、ADF含量與CH4產(chǎn)量呈負相關(guān)，這與前人研究結(jié)果[31-32]一致。造成這種結(jié)果的原因可能是體外模擬瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣不能完全代替體內(nèi)瘤胃動態(tài)產(chǎn)氣效果，因為體內(nèi)瘤胃CH4可以通過噯氣排出，達到CH4平衡目的。本試驗發(fā)現(xiàn)隨著NDF含量降低，丙酸/TVFA升高，這與前人研究結(jié)果[33-34]相同。NDS主要包括淀粉、脂肪、CP和礦物質(zhì)元素等，脂肪和礦物質(zhì)發(fā)酵對產(chǎn)生NH3-N、MCP、VFA和GP等發(fā)酵結(jié)果不做貢獻，基本上可以忽略不計，而淀粉作為重要的碳水化合物，影響反芻家畜的發(fā)酵模式，高淀粉含量傾向于丙酸生成，反之傾向于乙酸生成[35]。試驗結(jié)果表明NDS/CP與VFA比例、CH4產(chǎn)量沒有相關(guān)關(guān)系，而NDS含量、(NDS-Ash)/CP與TVFA、丙酸/TVFA和CH4產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。這可能是因為酒糟中一般含有較多的非淀粉多糖、酵母細胞和酵母細胞成分等物質(zhì)[36-37]，且有研究發(fā)現(xiàn)隨著酵母培養(yǎng)物添加量的增加，CH4產(chǎn)量呈二次降低的趨勢[38]，由于這些成分的影響，從而導致了與其他研究結(jié)果[39]相反的正相關(guān)關(guān)系。

4 結(jié) 論

① 青稞糟和玉米酒精糟產(chǎn)氣參數(shù)和發(fā)酵參數(shù)結(jié)果均高于其他酒糟，啤酒糟次之。醬香型發(fā)酵酒糟GP和CH4產(chǎn)量最低，且其他瘤胃發(fā)酵參數(shù)結(jié)果較好。醬香型酒糟和濃香型酒糟GP和發(fā)酵參數(shù)結(jié)果均較低，其進一步發(fā)酵加工后再飼用更佳。

② TVFA、VFA比例和CH4產(chǎn)量受不同類型酒糟營養(yǎng)成分的影響，相關(guān)性分析表明，TVFA濃度主要受NDF、ADF、NDS含量和(NDS-Ash)/CP的影響，CH4產(chǎn)量受CP、NDF、ADF、NDS含量和(NDS-Ash)/CP的影響。