高溫對3T3-L1前體脂肪細胞凋亡和脂肪沉積的影響

謝紅月 潘 鵬 胡 艷 張 瑜 羅云彥 胡旭旭 甄 銳 蔣欽楊 黃艷娜

(廣西大學動物科學技術學院，南寧530004)

高環境溫度是影響畜禽生長性能的最重要的氣候因素之一[1]。隨著全球氣候變暖的加劇，高溫成為了影響畜牧業生產的主要威脅之一[2]。當生物體遭受高溫時，熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)會迅速合成[2]。休熱克蛋白按分子質量的大小分為熱休克蛋白60(heat shock protein 60，HSP60)、熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)、熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)等。熱休克蛋白在應激細胞的存活和內部環境的穩定中起著重要作用[3]。同時，高溫可作為細胞凋亡的誘導因子。細胞凋亡是一個復雜的過程。細胞凋亡反應由2個重要的蛋白質家族半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族和B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)蛋白家族調控[4]。已有研究報道高溫可導致DNA損傷[5-6]和蛋白質錯誤折疊[7]，可引起組織損傷和細胞凋亡[8]。然而關于高溫是否會引起3T3-L1前體脂肪細胞的凋亡目前鮮有報道。

脂肪含量對畜禽肉質的感官品質具有十分重要的影響[9]。脂肪沉積過程受到多種轉錄因子和脂肪分泌因子的級聯調控，其中調控脂質代謝的相關基因包括脂肪合成基因過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)、脂肪酸結合蛋白2(fatty acid-binding protein 2，AP2)、CCAAT增強子結合蛋α(CCAAT/enhancer-binding protein α，C/EBPα)等，調控脂肪分解的相關基因包括激素敏感脂酶(hormone-sensitive triglayceride lipase，HSL)、脂肪甘油三酯脂酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)等。研究發現35 ℃條件下豬皮下脂肪組織中的脂質含量增加[10]。在高溫條件下，肉雞皮下脂肪細胞中脂肪沉積量顯著提高，脂肪合成相關基因的mRNA表達量顯著增加[11]。然而，目前尚不清楚高溫在體外3T3-L1前體脂肪細胞分化模型中的作用以及對于脂肪合成與分解相關基因的影響。因此，本試驗旨在研究高溫對3T3-L1前體脂肪細胞凋亡和分化過程中脂肪沉積的影響，以期為改善高溫對動物福利及畜禽肉品質的影響奠定理論基礎，并為預防由高溫引起的肥胖提供潛在策略。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

3T3-L1前體脂肪細胞由廣西大學遺傳育種實驗室提供。

1.2 細胞培養和誘導分化

將3T3-L1前體脂肪細胞懸浮于DMEM(Gibco，美國)和10%胎牛血清(FBS，Gibco，美國)中，在37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養箱中孵育，每2 d更換1次培養基，完全融合后，分別在37.0(對照)和41.5 ℃(高溫處理)條件下用誘導分化培養基[10%FBS、90%DMEM、1%青霉素/鏈霉素(Sigma-Aldrich，美國)、1 μmol/L地塞米松(Sigma-Aldrich，美國)、10 μg/mL胰島素(Gibco，美國)和0.5 mmol/L異丁基甲基黃嘌呤(Sigma-Aldrich，美國)]培養細胞，2 d后用10%FBS、90%DMEM和10 μg/mL胰島素替代分化培養基，繼續培養至第6天。

1.3 油紅O染色

誘導分化培養6 d后，吸棄培養基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞3次后，用10%的福爾馬林溶液固定細胞10 min，吸棄固定液，用PBS漂洗細胞3次，加入稀釋好的油紅O溶液(北京索萊寶科技有限公司)，染色20 min后吸棄染料，最后用PBS將多余染液清洗干凈，置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 總RNA提取及cDNA合成

使用Trizol法提取3T3-L1前體脂肪細胞中的總RNA，檢測總RNA的濃度和純度后，按照反轉錄試劑盒(TaKaRa，大連)說明書反轉錄成cDNA。反轉錄體系為：gDNA Eraser 1 μL、5×gDNA Eraser Buffer 2 μL、總RNA 1 μg，RNase Free H2O補足體系至10 μL，得到Mix1溶液，42 ℃保溫2 min。在Mix1溶液中加入PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1 μL、5×PrimeScript Buffer Ⅱ 4 μL、RT Primer Mix 1 μL，RNase Free H2O補足體系至20 μL，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，獲得cDNA，4 ℃保存。

“**”表示差異極顯著(P<0.01)，“***”表示差異極顯著(P<0.001)。圖3、圖5和圖6同。

1.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

以cDNA為模板進行qRT-PCR，反應體系為：TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa，大連)5 μL、上游引物0.25 μL、下游引物0.25 μL、cDNA 2.5 μL、RNase Free H2O 2 μL。反應程序為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，45個循環，65 ℃延伸5 s，95 ℃再延伸5 min。以18S rRNA為內參，依據2-△△Ct方法計算目的基因的mRNA表達量。每個樣品重復3次。本試驗用到的實時熒光定量PCR引物見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物

續表1基因 Genes引物序列Primer sequences (5′—3′)產物長度Product length/bp熱休克蛋白90 HSP90[14]F:GTCTCGTGCGTGTTCATTCAR:CATTAACTGGGCAATTTCTGC116半胱天冬氨酸蛋白酶-3 Caspase-3[15]F:TGTCATCTCGCTCTGGTACGR:AAATGACCCCTTCATCACCA201半胱天冬氨酸蛋白酶-9 Caspase-9[16]F:GGTCACGGCTTTGATGGAGATR:CCACCTCAAAGCCATGGTCTT260B細胞淋巴瘤-2 Bcl-2[17]F:ATGCCTTTGTGGAACTATATGGCR:GGTATGCACCCAGAGTGATGC120Bcl-2相關X蛋白 Bax[18]F:TGCAGAGGATGATTGCTGACR:GATCAGCTCGGGCACTTTAG173過氧化物酶體增殖劑激活受體γ PPARγ[19]F:GATGGAAGACCACTCGCATTR:AACCATTGGGTCAGCTCTTG115CCAAT增強子結合蛋α C/EBPα[13]F:TGGACAAGAACAGCAACGAGR:TCACTGGTCAACTCCAGCAC127脂肪酸合成酶 FAS[13]F:CCCTTGATGAAGAGGGATCAR:ACTCCACAGGTGGGAACAAG115脂肪酸結合蛋白2 AP2[13]F:TCAGCGTAAATGGGGATTTGGR:GTCTGCGGTGATTTCATCGGA104乙酰輔酶A羧化酶 ACC[19]F:GGCAGCAGTTACACCACATACR:TCATTACCTCAAAATCTCAGCATAGC169脂肪甘油三酯脂酶 ATGL[19]F:ATGGTGCCCTACACGCTGR:GCCTGTCTGCTCCTTTATCC111激素敏感脂酶 HSL[19]F:CTTTGCGGGTATTCGGGAACAR:ATGCTGCGGCGGTTGGA19218S rRNA[19]F:CCCACGGAATCGAGAAAGAGR:TTGACGGAAGGGCACCA122

1.6 統計分析

試驗結果以平均值±標準誤(mean±SE)表示，并采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD法多重比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01和P<0.001表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 高溫對3T3-L1前體脂肪細胞分化過程中熱休克蛋白家族基因表達的影響

本試驗檢測了熱休克蛋白家族中具有高度保守性的3個基因HSP60、HSP70、HSP90的mRNA表達量。由圖1可知，經高溫處理6 d后，HSP60的mRNA表達量是對照組的1.69倍(P<0.001)；HSP70的mRNA表達量是對照組的6.95倍(P<0.001)；HSP90的mRNA表達量是對照組的1.13倍(P<0.01)。結果表明，3T3-L1前體脂肪細胞經高溫處理后，通過高度誘導熱休克蛋白家族基因的表達來起到自身保護的作用。

2.2 高溫對3T3-L1前體脂肪細胞凋亡的影響

由圖2可知，高溫處理4 d后，顯微鏡下可觀察到細胞趨于不規則形態，在沒有換液的情況下可見死亡細胞漂浮于培養基中，在表觀上說明高溫可誘導3T3-L1前體脂肪細胞凋亡。

圖2 高溫對3T3-L1前體脂肪細胞凋亡的影響

2.3 高溫對3T3-L1前體脂肪細胞凋亡相關基因表達的影響

由圖3可知，高溫處理4 d后Caspase-3的mRNA表達量是對照組的1.14倍(P<0.01)，Caspase-9的mRNA表達量是對照組的1.13倍(P<0.01)，Bcl-2/BaxmRNA比值較對照組極顯著降低(P<0.001)，說明經高溫處理后細胞發生凋亡。

圖3 高溫處理4 d后凋亡相關基因的mRNA表達量

2.4 高溫對3T3-L1前體脂肪細胞成脂分化的影響

高溫處理細胞后，在顯微鏡下觀察高溫對細胞誘導分化的情況。由圖4可知，高溫誘導分化6 d時，脂滴占據大部分視野，細胞的分化程度高于對照組。油紅O染色后可看到細胞經過高溫處理后脂滴數量明顯增多。

2.5 高溫對3T3-L1前體脂肪細胞分化過程中脂肪合成相關基因表達的影響

由圖5可知，經高溫處理6 d后，PPARγ的mRNA表達量是對照組的1.55倍(P<0.001)；AP2的mRNA表達量是對照組的3.41倍(P<0.001)；FAS的mRNA表達量是對照組的1.36倍(P<0.001)；ACC的mRNA表達量是對照組的1.09倍(P<0.01)；CEBPα的mRNA表達量是對照組的1.60倍(P<0.001)。上述結果表明，經過高溫處理后，3T3-L1前體脂肪細胞中脂肪合成相關基因的表達量極顯著上調。

D6表示高溫處理6 d。圖A為在37.0 ℃條件下分化第6天的3T3-L1前體脂肪細胞；圖B為在37.0 ℃條件下分化第6天的3T3-L1前體脂肪細胞的油紅O染色圖；圖C為在41.5 ℃條件下分化第6天的3T3-L1前體脂肪細胞；圖D為在41.5 ℃條件下分化第6天的3T3-L1前體脂肪細胞的油紅O染色圖。

圖5 高溫處理6 d后脂肪合成相關基因的mRNA表達量

2.6 高溫對3T3-L1前體脂肪細胞分化過程中脂肪分解相關基因表達的影響

由圖6可知，高溫處理6 d后，ATGL和HSL的mRNA表達量均下降，其中ATGL的mRNA表達量較對照組降低了20%(P<0.001)，HSL的mRNA表達量較對照組降低了65%(P<0.001)。上述結果表明，經過高溫處理后，3T3-L1前體脂肪細胞中脂肪分解相關基因的表達量極顯著下調。

圖6 高溫處理6 d后脂肪分解相關基因的mRNA表達量

3 討 論

高溫是畜禽養殖業遇到的最嚴重的威脅之一。據報道，在熱帶或亞熱帶國家，持續高溫，特別是夏季高溫，是畜禽生產的不利因素。持續高溫暴露會降低采食量[20]、生長性能[21]和肉質[22-23]。例如，高溫降低了肌內脂肪(IMF)沉積[24]，改變了肉的pH[22]。前體脂肪細胞起源于多潛能干細胞，并且尚未積累儲存甘油三酯(TG)。脂肪細胞由前體脂肪細胞分化而來，占脂肪組織細胞總數的1/3～2/3，脂肪細胞在脂肪組織的發育中起著決定性的作用，脂肪組織的發育情況決定了機體脂肪的沉積與代謝[25]。因此，在細胞水平上探究高溫對細胞凋亡和脂肪沉積與代謝的影響，能夠更清楚地了解其發生機理，可為改善高溫對畜禽的不利影響以及改善肉品質提供科學理論依據。

細胞以多種方式對高溫做出反應，如刺激存活途徑或觸發受損細胞的死亡，這些應激細胞的初始反應有助于細胞從應激狀態中恢復[26]。熱休克蛋白的表達是機體對高溫的第一反應。熱休克蛋白是一種參與應激反應的蛋白質，它保護生物體免受壓力的傷害，幫助它們恢復，從而提高細胞存活率[27]。高溫會導致豬背最長肌HSP70和HSP90基因的表達量增加[2]。高溫條件下肉雞心臟、肝臟和腎臟中HSP60基因的表達量均上調[28]。本試驗對HSP60、HSP70、HSP90 3個基因mRNA表達量的研究結果發現，高溫極顯著促進3個熱休克蛋白的合成。此外，Wang等[29]在HepG2細胞上的研究同樣顯示出高溫對熱休克蛋白合成的促進作用。

Caspase家族參與兩大凋亡級聯即死亡受體途徑和線粒體途徑，是細胞凋亡的最終執行者。在線粒體途徑中，通過二聚作用激活啟動子Caspase-9，活化的Caspase-9蛋白水解激活了劊子手Caspases-3，Caspase-3通常以32 ku的酶原形式存在于細胞質中，在細胞凋亡的早期被激活。線粒體的完整性也受Bcl-2蛋白家族的控制。Bcl-2蛋白家族中促凋亡(Bax)和抗凋亡成員(Bcl-2)之間相互作用共同調控細胞凋亡[30-31]。Bax通過結合Bcl-2抑制細胞凋亡。本試驗結果表明，高溫導致Caspase-9和Caspase-3的mRNA表達量極顯著上調，Bcl-2/BaxmRNA比值極顯著下降，說明高溫會引起3T3-L1前體脂肪細胞的凋亡。

脂滴是參與脂質儲存和動員的關鍵細胞器[32-33]。幾乎所有的細菌和真核細胞都能積累中性脂質，并將其儲存在脂滴中。脂滴通常呈球形，含有多種中性脂質，并被單層磷脂和外周蛋白所包圍[34]。脂滴參與TG的合成，并且在降解TG方面也有重要作用[35]。同時脂滴可作為前體脂肪細胞分化成熟的標志。Qu等[36]提出，豬皮下脂肪細胞在41.5 ℃溫度下會刺激脂滴的形成，并且增加血清中TG含量。本試驗通過油紅O染色發現，高溫能夠明顯促進脂滴的生成，從表觀上證明了高溫對3T3-L1前體脂肪細胞成脂分化的促進作用。研究表明，PPARγ在3T3-L1前體脂肪細胞中以低水平表達，在正常細胞分化條件下被顯著誘導[13]。C/EBPα作為關鍵轉錄因子，可促進FAS和AP2基因的表達，從而促進脂肪細胞分化[37]。在分化末期，參與TG代謝的基因AP2、ACC、FAS的表達量顯著增加，導致細胞內的形態發生改變和脂質積累[38]。高溫可顯著提高肉雞肝臟中ACC、FAS和腹脂中FASmRNA的表達量[39]。另外，41.5 ℃可促進豬皮下脂肪細胞PPARγ和C/EBPα的mRNA表達，并且在第6天達到最大值[36]。細胞內的脂解酶包括ATGL和HSL[40-42]。HSL是第1個被發現在哺乳動物脂肪組織中水解TG的酶。第2個被發現的是ATGL，它是催化TG水解的初始步驟，在小鼠和人類的脂肪組織中高表達，定位于脂滴上[43-45]。研究發現，高溫降低了豬皮下脂肪組織中ATGL和HSL的mRNA表達量[46]。本試驗檢測了高溫處理6 d后脂肪合成與分解相關基因的mRNA表達量，結果顯示，高溫處理使得PPARγ、AP2、FAS、C/EBPα和ACC的mRNA表達量被極顯著上調，ATGL和HSL的mRNA表達量被極顯著下調，說明高溫會促進脂肪合成，抑制脂肪分解，最終導致脂質積累。油紅O染色的果與此結論相一致。

本試驗結果表明，高溫促進了熱休克蛋白的表達，引起了3T3-L1前體脂肪細胞的凋亡。高溫刺激了脂滴的生成，促進了分化過程中參與脂肪生成的多個基因的表達，降低了脂肪分解相關基因的表達。這些結果可為高溫期間的3T3-L1前體脂肪細胞反應提供依據，并為改善高溫對畜禽肉品質的不良影響奠定理論基礎。

4 結 論

高溫會引起3T3-L1前體脂肪細胞的熱休克反應，導致細胞凋亡，促進脂肪酸的合成，抑制脂肪酸的分解，增加脂質累積。