艾葉揮發油對脂多糖誘導的巨噬細胞的抗炎作用

2021-07-12 03:22:14曹謹玲陳劍杰李麗娟常藕琴黃志斌

動物營養學報 2021年6期

曹謹玲陳劍杰李麗娟常藕琴黃志斌*

(1.山西農業大學食品科學與工程學院，太谷030801；2.山西農業大學動物醫學學院，太谷030801； 3.山西農業大學信息學院，太谷030801；4.中國水產科學院珠江水產研究所，農業農村部漁用藥物創制重點實驗室，廣東省水產動物免疫技術重點實驗室，廣州510380)

炎癥是機體對各種外源致炎因素刺激而產生的一種生理和病理性過程，是機體對外界刺激防御反應的重要組成部分，但是過度的炎癥也是許多疾病的重要組成部分，嚴重的還導致生命威脅[1-3]。許多研究表明一些疾病的發生發展都會伴隨有炎癥的發生，二者擁有比較緊密的關系，如哮喘、癌癥、動脈粥樣硬化、糖尿病等[4-6]。艾葉(Artemisiaeargyi)為菊科植物艾的葉，在我國大部分地區都有生長。艾葉揮發油(Artemisiaargyiessential oils，AAEO)是艾葉的主要有效成分，具有多種藥理功效。Zhang等[7]研究發現，AAEO具有殺蟲藥效，可用于殺滅谷物和中草藥中昆蟲；Akhbari等[8]研究表明，AAEO具有清除自由基的活性；丁圓平等[9]研究表明，AAEO可抑制肺癌A549細胞增殖并誘導細胞凋亡；葛德鵬等[10]研究表明，AAEO可作用于微生物細胞壁結構從而起到抑菌作用；Xiang等[11]研究表明，AAEO對金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等具有抑制作用。但是，目前對于AAEO抗炎活性特別是抗炎機制方面的研究還鮮有報道。

巨噬細胞作為機體非特異性免疫的重要參與者，不但可以參與到較多的機體免疫反應中，且在炎癥反應的進程中也起著不可替代的作用[12-13]。在炎癥反應中，巨噬細胞能夠通過分泌細胞因子及抗原提呈等作用對炎癥反應進程起到影響和調控作用[14-16]。因此，本試驗通過脂多糖(LPS)誘導小鼠巨噬細胞(RAW264.7細胞)建立細胞炎癥模型來研究AAEO的抗炎能力，為進一步探討AAEO的抗炎功效及為其作為綠色安全飼用添加劑的可能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑與儀器

AAEO提取參照《中國藥典》(2015版)水蒸氣蒸餾法進行：稱取艾葉500 g，粉碎后放于10 L的圓底燒瓶中，加入5 L蒸餾水浸泡過夜，水蒸氣蒸餾法提取6 h，收集揮發油，經無水Na2SO2干燥后封裝備用，測定AAEO產率為0.48%。AAEO主要成分為：1,8桉葉素(1,8 eucalyptol，2.89%)、4-萜烯醇[4-methyl-1-(1-methylethyl)-3-cyclohexen-1-ol，6.56%]、龍腦(borneol，5.94%)、樟腦(camphor，3.31%)、松油醇(p-menth-1-en-8-ola，3.82%)、2,4,6-三甲基苯基-2,4,6-三甲基苯甲酸酯(2,4,6-trimethylphenyl 2,4,6-trimethyl enzoate，4.85%)、石竹烯(caryophyllene，5.84%)。

RAW264.7細胞、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、DMEM培養基、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)試劑盒購自索萊寶科技有限公司。細胞計數試劑盒(CCK8)、LPS購自美國Sigma公司。一氧化氮(NO)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RNAiso Plus、反轉錄試劑盒、AYBR Green PCR Kit購自大連TaKaRa公司。

主要儀器包括CJX41S倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、SpectraMax i3x多功能酶標儀(奧地利Molecular Devices公司)、熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)、低溫高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)、SW-CJ-1F潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)、3111型二氧化碳(CO2)培養箱(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養

將小鼠RAW264.7細胞置于DMEM培養液(含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 IU/mL鏈霉素)中，在37 ℃、5% CO2的培養箱里培養。

1.2.2 細胞毒性的測定[17]

調整對數生長期的RAW264.7細胞密度到4×105個/mL，接種于48孔培養板中，每孔100 μL。試驗設置空白對照組[添加濃度為0.1%二甲基亞砜(DMSO)的培養基]和試驗組[分別添加濃度為5、10、20、40、80、160 μg/mL的AAEO(提取的AAEO加入DMSO助溶，培養基稀釋到試驗用濃度，DMSO濃度為0.1%)]，并設置3個重復孔，培養24 h后，除去孔內培養基，每孔添加100 μL的含有10% CCK8溶液的培養基，培養2 h后采用酶標儀測定每孔在波長450 nm時的吸光度。

1.2.3 試驗分組及NO含量的測定

調整對數生長期的RAW264.7細胞密度到5×105個/mL，接種于6孔培養板中，每孔500 μL。設置對照組(添加濃度為0.1% DMSO的培養基)、LPS組(添加濃度為1 μg/mL LPS的培養基)、不同濃度AAEO組(分別添加5、10、20 μg/mL的AAEO，預處理1 h，再添加濃度為1 μg/mL LPS的培養基)，每組設置3個重復孔。培養24 h后，收集上清用于NO含量的測定，其含量應用Griess法，按照試劑盒的步驟進行測定。

1.2.4 細胞炎癥因子含量的測定

將處于對數生長期的RAW264.7細胞接種于12孔板(細胞密度為5×105個/mL)進行培養。依據試驗分組孵育24 h后，收集細胞上清，采用酶聯免疫吸附法測定TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1含量，具體測定步驟按照試劑盒說明進行。

1.2.5 細胞炎癥因子表達的檢測

將處于對數生長期的RAW264.7細胞接種于24孔板(細胞密度為1×106個/mL)，依據試驗分組孵育24 h后，收集細胞提取mRNA并轉錄為cDNA，利用熒光定量PCR儀檢測TNF-α、IL-1β、IL-6和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA表達量，具體操作步驟按照試劑盒說明進行，β-肌動蛋白(β-actin)作為管家基因，2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達量。NCBI數據庫查詢得到的基因序列，應用引物設計軟件Primer Premier 6設計引物序列(表1)。

表1 引物序列

1.3 數據分析

應用SPSS 22.0統計軟件對試驗所得數據進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，數據以平均值±標準誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 AAEO對RAW264.7細胞毒性評價

由圖1可知，與AAEO濃度為0 μg/mL時相比，AAEO濃度為5～20 μg/mL時，RAW264.7細胞活力分別上升了5.34%(P<0.05)、14.76%(P<0.05)和34.68%(P<0.05)；AAEO濃度為40～160 μg/mL時，RAW264.7細胞活力分別下降了0.81%(P>0.05)、2.06%(P>0.05)和19.98%(P<0.05)。RAW264.7細胞活力在AAEO濃度為20 μg/mL時最高，在AAEO濃度為160 μg/mL時最低。因此，選擇5、10、20 μg/mL作為后續試驗AAEO濃度。

數據柱標注相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 AAEO對LPS誘導的RAW264.7細胞NO含量的影響

由圖2可知，與對照組相比，LPS組RAW264.7細胞NO含量顯著升高(P<0.05)；與LPS組相比，5、10、20 μg/mL AAEO組RAW264.7細胞NO含量均顯著降低(P<0.05)，分別下降了24.4%、35.0%和47.8%。相關性分析表明，AAEO濃度與NO含量呈負相關(皮爾遜相關系數為-0.907，P<0.05)。

#表示與對照組比較差異顯著(P<0.05)，*表示與LPS組比較差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.3 AAEO對LPS誘導的RAW264.7細胞炎性因子含量的影響

由圖3可知，與對照組相比，LPS組RAW264.7細胞TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1含量均顯著升高(P<0.05)。與LPS組相比，5、10、20 μg/mL AAEO組RAW264.7細胞TNF-α含量顯著降低(P<0.05)，分別下降了14.45%、24.29%和32.71%。相關性分析表明，AAEO濃度與TNF-α含量呈負相關(皮爾遜相關系數為-0.877，P<0.05)。

圖3 AAEO對LPS誘導的RAW264.7細胞炎性因子含量的影響

與LPS組相比，10、20 μg/mL AAEO組RAW264.7細胞IL-1β含量顯著降低(P<0.05)，分別下降了37.08%和52.97%。相關性分析表明，AAEO濃度與IL-1β含量呈負相關(皮爾遜相關系數為-0.706，P<0.05)。

與LPS組相比，5、10、20 μg/mL AAEO組RAW264.7細胞IL-6含量顯著降低(P<0.05)，分別下降了25.19%、35.87%和38.86%。相關性分析表明，AAEO濃度與IL-6含量呈負相關(皮爾遜相關系數為-0.753，P<0.05)。

與LPS組相比，5、10、20 μg/mL AAEO組RAW264.7細胞MCP-1含量顯著降低(P<0.05)，分別下降了11.18%、28.15%和39.20%。相關性分析表明，AAEO濃度與MCP-1含量呈負相關(皮爾遜相關系數為-0.806，P<0.05)。

2.4 AAEO對LPS誘導的RAW264.7細胞炎性因子mRNA相對表達量的影響

由圖4可知，與對照組相比，LPS組RAW264.7細胞TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOSmRNA相對表達量均升高顯著(P<0.05)。與LPS組相比，10、20 μg/mL AAEO組RAW264.7細胞TNF-αmRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)。相關性分析表明，AAEO濃度與TNF-αmRNA相對表達量呈負相關(皮爾遜相關系數為-0.856，P<0.05)。

圖4 AAEO對LPS誘導的RAW264.7細胞炎性因子mRNA相對表達量的影響

與LPS組相比，10、20 μg/mL AAEO組RAW264.7細胞IL-1βmRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)。相關性分析表明，AAEO濃度與IL-1βmRNA相對表達量呈負相關(皮爾遜相關系數為-0.752，P<0.05)。

與LPS組相比，5、10、20 μg/mL AAEO組RAW264.7細胞IL-6 mRNA相對表達量均顯著降低(P<0.05)。相關性分析表明，AAEO濃度與IL-6 mRNA相對表達量呈負相關(皮爾遜相關系數為-0.873，P<0.05)。

與LPS組相比，5、10、20 μg/mL AAEO組RAW264.7細胞iNOSmRNA相對表達量均顯著降低(P<0.05)。相關性分析表明，AAEO濃度與iNOSmRNA相對表達呈負相關(皮爾遜相關系數為-0.806，P<0.05)。

3 討論

炎癥反應是一種復雜的宿主防御過程，是通過免疫系統調節清除不利因素侵入的過程[17]。正常情況下炎癥反應體現的是對人體有利的方面，但是隨著炎癥介質的持續增多，會對機體組織產生嚴重的負面影響，導致疾病的發生、加重。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的重要組成部分，不但可以誘導促炎性細胞因子的釋放，還可以促使炎癥介質的產生，被認為是導致炎癥反應的因素之一[18-19]。巨噬細胞作為免疫細胞具有多種功能，不但能夠消除細胞碎片及病原微生物，還能夠分泌細胞因子等介質，小鼠RAW264.7細胞擁有穩定性好、可傳代培養的優點[20-21]。因此，在體外試驗中常常使用LPS誘導RAW264.7細胞作為體外炎癥細胞模型[22-23]。為了明確AAEO對細胞活力的作用，本試驗應用CCK8法測定了不同濃度AAEO對RAW264.7細胞的毒性，并明確了試驗中AAEO的安全濃度范圍，結果顯示，AAEO濃度在5～20 μg/mL時對RAW264.7細胞活性無抑制作用，提示此濃度范圍的AAEO對RAW264.7細胞無細胞毒性作用，進一步說明本研究所采用的5、10和20 μg/mL的AAEO在LPS誘導的細胞炎癥中呈現的抗炎活性并不是通過降低細胞活性來完成的。

細胞因子是由細胞釋放的小分子生物活性物質，可以通過多種途徑調節免疫應答和參與炎癥反應[12,24]。LPS可以誘導刺激巨噬細胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1等炎性細胞因子。TNF-α是炎癥反應過程中具有關鍵作用的炎癥介質，TNF-α在自身分泌的過程中還能夠誘導白細胞介素的分泌，進一步促使炎癥的反應，TNF-α分泌的增加還可以刺激MCP-1的形成，進一步引起炎癥損傷[25-26]。IL-1β是一種可以誘發炎癥反應以及機體防御反應的炎性細胞因子，能夠激活多種免疫細胞和炎性細胞，形成與TNF-α類似的生理及代謝作用，與TNF-α協同作用，是誘導炎癥反應重要的介質之一[17,27]。IL-6來源于經過TNF-α和IL-1β誘導的細胞和組織，參與機體內信號分子之間的傳遞并引起炎癥反應，其含量高低能夠反映機體的炎癥和組織損傷程度[28-29]。本試驗發現，LPS誘導RAW264.7細胞可以使其分泌的細胞因子含量增加，這與于笛等[12]、高銘彤等[24]、李帥帥[30]研究結果一致。AAEO能夠抑制LPS誘導的巨噬細胞促炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1的過多分泌，提示AAEO可以通過調控細胞炎癥因子的分泌來體現其抗炎作用。

NO是一種生物活性物質，擁有促炎和抗炎雙重作用，過多NO是有害的且能夠引起各種炎癥和疾病[24]。本研究通過檢測發現，LPS組RAW264.7細胞NO含量比對照組顯著升高，5、10、20 μg/mL AAEO組RAW264.7細胞NO含量比LPS組均顯著降低，且呈現一定的劑量效應關系。由此可見，AAEO在一定程度上可以通過抑制NO的釋放來呈現其抗炎功能。本試驗還進一步檢測了AAEO對NO的上游關鍵酶iNOS的mRNA和促炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達的影響，結果顯示AAEO可以抑制LPS誘導巨噬細胞炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS的mRNA表達，說明AAEO可以通過抑制TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS的mRNA表達來發揮抗炎活性。