飼養方式和飼糧能量水平對牦牛生長性能、瘤胃發酵參數和瘤胃菌群的影響

張振宇 梁春年 姚喜喜 丁考仁青 馬曉明 褚 敏 吳曉云 包鵬甲 閻 萍*

(1.中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州730050；2.青海大學農牧學院，西寧810016； 3.甘南藏族自治州畜牧工作站，合作747000)

牦牛(Bosgrunniens)是長毛牛屬中唯一生活在平均海拔3 000 m以上地區的特有牛種[1]。我國牦牛的飼養管理受分布地區艱苦的環境、落后的生產方式影響而處于滯后狀態，牧民依靠天然放牧且較少進行補飼。隨著科技的進步，牦牛的飼養方式也在發生轉變，傳統牧養已無法適應社會發展，牦牛飼養方式正由輪牧到全舍飼飼養轉變。近年來，在農牧交錯帶推廣牦牛季節性舍飼育肥被認為是縮短養殖周期、提高生產力和改良肉品質的主要途徑[2]。陳科宇[3]針對麥洼牦牛在冬春兩季不同飼養方式下的經濟效益和生長性能進行了研究，發現冷季舍飼育肥組的體重極顯著高于自然放牧組。動物機體生長發育受多種外在因素(飼養方式、圈舍條件、溫度、營養水平等)以及動物自身(血液生化指標、酶、激素水平等)的影響，表現在體尺和體重的變化。阿依努爾·托合提等[4]研究了栓系和散欄這2種飼養方式對肉牛增重性能的影響，發現散欄飼養組的日增重比栓系飼養組提高了21.8%。飼糧能量利用率也是影響動物生產性能的重要因素，利用率的高低主要取決于飼糧能量水平[5]。李亞茹等[6]在冷季對飼喂不同能量水平飼糧的舍飼牦牛的生長性能進行了測定，結果表明，隨著飼糧能量水平的變化，平均日增重也發生變化。反芻動物對營養物質的吸收與轉化均離不開瘤胃[7]。在目前的研究中，飼糧被認為是影響瘤胃微生物區系的主要因素[8]。對瘤胃微生物區系進行研究，有助于認識瘤胃這個復雜的動態系統，在高效利用飼料、提高動物生產等方面具有重要意義。

因此，本試驗參考國內外肉牛育肥經驗，結合當地農牧交錯帶的實際條件，設計了栓系和散欄2種飼養方式和低、中、高3種飼糧能量水平，探究不同飼養方式和飼糧能量水平對牦牛生長性能、瘤胃發酵參數和瘤胃菌群的影響，以期為農牧交錯帶牦牛的飼養管理和牦牛產業合理的提質增效提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

采用3×2雙因素試驗設計，即低、中、高3種飼糧能量水平和栓系、散欄2種飼養方式，選取體重(269.75±35.46) kg、體型接近、健康狀況良好的同齡段公牦牛60頭，隨機分為6組，分別為栓系低能組(TL組)、栓系中能組(TM組)、栓系高能組(TH組)、散欄低能組(CL組)、散欄中能組(CM組)、散欄高能組(CH)組，每組10頭。按照我國《肉牛飼養標準》[9](NY/T 815—2004)中體重300 kg、日增重1 kg肉牛營養需求，以80%全株青貯玉米和20%小麥秸稈為粗飼料，以玉米、小麥麩、菜籽粕、小蘇打、氯化鈉、預混料為精料補充料原料，配制綜合凈能(NEmf)分別為5.51(低能量水平)、6.22(中能量水平)、6.94 MJ/kg(高能量水平)的3種試驗飼糧，精料補充料組成及TMR營養水平見表1。

表1 精料補充料組成及TMR營養水平(干物質基礎)

續表1項目 Items能量水平 Energy levels低 L中 M高 H粗脂肪 EE4.684.684.68中性洗滌纖維 NDF14.5113.2412.18酸性洗滌纖維 ADF4.163.843.29鈣 Ca0.740.740.74磷 p0.370.370.37

1.2 飼養管理

飼養試驗在甘肅省臨夏回族自治州八坊清河源公司進行，預試期15 d，正試期90 d。試驗牛入舍前對牛舍進行全面消毒殺菌，所有參試牛進行常規體況檢查，驅蟲、免疫并編號。試驗期間，每天認真觀察牛的采食、飲水、反芻和排便等狀況，并做好記錄。各組牦牛每天定時(08:00和17:00)飼喂2次，每次每頭牛飼喂4 kg全株青貯玉米、1 kg小麥秸稈和2 kg精料補充料，采用全混合日糧(TMR)飼喂方式，期間自由飲水，定期對牛欄進行打掃和消毒。

1.3 樣品采集

試驗結束當天，每組隨機選取3頭牛，屠宰后采集瘤胃液，用于測定瘤胃發酵參數和瘤胃菌群組成與多樣性。將采集的瘤胃液徹底混合并用4層紗布過濾，立即測定瘤胃pH；取約50 mL用于測定氨態氮(NH3-N)和揮發性脂肪酸(VFA)濃度；另取2 mL用于DNA的提取及下一步的測序分析。將瘤胃液分裝后迅速投入液氮中，然后轉移至-80 ℃冰箱保存，以備送檢。

1.4 指標測定

1.4.1 生長性能測定

分別于試驗第1、30、60、90天進行體重測量，計算試驗第1、2、3個月的增重；通過記錄的采食量和增重數據，計算試驗全期的平均日增重、干物質采食量和料重比。

1.4.2 瘤胃發酵參數測定

瘤胃液pH使用pHSJ-3型pH測定儀測定。瘤胃液揮發性脂肪酸濃度使用安捷倫氣相色譜儀(Agilent 7890A GC System，美國)采用氣相色譜法測定，氣相色譜儀內裝氫火焰離子化檢測器(FID)，載氣為高純氮氣，柱溫箱參數：程序升溫75～190 ℃，檢測器參數：氫氣流量30 mL/min，空氣流量400 mL/min，氫火焰離子化檢測器溫度為300 ℃。瘤胃液氨態氮濃度采用Broderick等[10]的方法測定。

1.4.3 瘤胃微生物多樣性

1.5 生物信息學分析

測序結束后，用Flash 1.2.7進行reads拼接，Qiime 1.7.0進行tags質控過濾，Uchime algorithm去除嵌合體序列，根據barcode確定對應樣品，去除barcode和引物序列，在97%的相似度下用Qiime 1.7.0將序列歸為多個分類操作單元(operational taxonomic unit，OTU)，對序列進行比對分析，挑選每個OTU中豐度最高的序列為代表序列，使用RDP Classifier 2.2進行物種注釋，得到OTU的分類信息，利用Qiime 1.7.0和R software 4.0.2計算α多樣性指數——Chao1、Shannon、Simpson、ACE指數及物種覆蓋度(Coverage)，統計各個樣品每個OTU中的豐度信息，獲得Unweight Unifrac距離矩陣，利用非加權平均(UPGMA)法進行聚類，利用R語言作圖，同時對微生物群落進行Unifrac分析，判斷不同樣品遺傳學上的距離遠近，比較樣品間的差異。

1.6 數據統計與分析

試驗數據經Excel 2010初步整理，再用SPSS 21.0進行一般線性模型(GLM)雙因素方差分析，采用Duncan氏法進行多重比較，顯著水平為P<0.05，數據均以平均值和均值標準誤(SEM)的形式表示。

2 結果與分析

2.1 飼養方式和飼糧能量水平對牦牛生長性能的影響

由表2可知，在栓系飼養方式下，牦牛的終末體重和平均日增重均隨飼糧能量水平的增加而升高，TH組顯著高于TL和TM組(P<0.05)；在散欄飼養方式下，牦牛的終末體重和平均日增重均隨飼糧能量水平的增加呈現先升高后降低的趨勢，CM組顯著高于CL組(P<0.05)。在栓系飼養方式下，牦牛的料重比隨飼糧能量水平的增加顯著降低(P<0.05)；在散欄飼養方式下，CM組牦牛的料重比最小，顯著低于CL和CH組(P<0.05)。飼養方式和飼糧能量水平的交互作用對牦牛的終末體重和料重比具有顯著影響(P<0.05)。

表2 飼養方式和飼糧能量水平對牦牛生長性能的影響

2.2 飼養方式和飼糧能量水平對牦牛瘤胃發酵參數的影響

由表3可知，在栓系和散欄2種飼養方式下，瘤胃液pH均隨飼糧能量水平的增加表現出下降的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。瘤胃液NH3-N濃度以CM組最低，顯著低于CL、CH、TL和TH組(P<0.05)，與TM組差異不顯著(P>0.05)。在栓系和散欄2種飼養方式下，瘤胃液乙酸濃度均隨飼糧能量水平的增加而顯著降低(P<0.05)。在栓系飼養方式下，瘤胃液丙酸濃度隨飼糧能量水平的增加而升高，但組間差異不顯著(P>0.05)；在散欄飼養方式下，瘤胃液丙酸濃度隨飼糧能量水平的增加先升高而后降低，CM組顯著高于CH和CL組(P<0.05)。在栓系飼養方式下，隨著飼糧能量水平的增加，乙丙比顯著升高(P<0.05)。

表3 飼養方式和飼糧能量水平對牦牛瘤胃發酵參數的影響

2.3 飼養方式和飼糧能量水平對牦牛瘤胃菌群的影響

2.3.1 飼養方式和飼糧能量水平對牦牛瘤胃菌群豐富度和多樣性的影響

2.3.1.1 牦牛瘤胃菌群物種注釋

18個樣本下機數據經過優化后共得到1 014 202條優化序列。采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似度的OTU進行分類學分析，18個樣本中共注釋得到24個門，52個綱，116個目，194個科，377個屬，772個種以及3 109個OTU。

維恩圖(圖1)顯示，6組之間共有1 683個OTU，CL組特有59個OTU，CM組特有34個OTU，CH組特有53個OTU，TL組特有16個OTU，TM組特有8個OTU，TH組特有10個OTU，表明各組OTU組成相似度較高，差異較小。

圖1 維恩圖

樣品稀釋曲線一般用來說明樣本的取樣大小是否合理，通過稀釋曲線，可以反映樣本取樣深度的情況。本試驗采用多樣性指數sobs(表征實際觀測到的物種數目)作圖，由圖2可知，各樣本稀釋曲線趨于平坦，說明測序量足夠。

2.3.1.2 牦牛瘤胃菌群α多樣性分析

牦牛瘤胃菌群α多樣性分析結果(表4)顯示，在栓系飼養方式下，隨著飼糧能量水平的提高，ACE和Chao1指數逐漸降低，TH組顯著低于TL和TM組(P<0.05)；在散欄飼養方式下，隨著飼糧能量水平的提高，ACE和Chao1指數顯著降低(P<0.05)。Coverage能較好地反映樣本的測序深度，6組樣本的Coverage均在0.99以上，說明本次測序結果能代表樣本的真實情況。

表4 牦牛瘤胃菌群α多樣性分析

在97%序列相似性的基礎上繪出的6個組共18個個體的稀釋曲線。

2.3.2 飼養方式和飼糧能量水平對牦牛瘤胃菌群組成的影響

由圖3-A和表5可知，在門水平上，6個組的優勢菌門均為擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)，其次為桿狀菌門(Patescibacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、互養菌門(Synergistetes)和疣微菌門(Verrucomicrobia)，但各優勢菌門的相對豐度有所不同。在栓系飼養方式下，擬桿菌門的相對豐度隨飼糧能量水平的增加而升高，TH組顯著高于TL組(P<0.05)；在散欄飼養方式下，CM組擬桿菌門的相對豐度最高，顯著高于CH組(P<0.05)，與CL組的差異不顯著(P>0.05)。

表5 牦牛瘤胃菌群門水平的組成

續表5項目Items組別 GroupsTLTMTHCLCMCHSEMP值 P-valueABA×B桿狀菌門Patescibacteria1.641.541.532.921.803.030.200.270.240.38放線菌門Actinobacteria1.451.171.000.920.881.020.080.120.280.50互養菌門Synergistetes1.010.370.640.150.190.260.100.150.400.86疣微菌門Verrucomicrobia0.680.720.860.410.520.570.070.030.480.99螺旋體門Spirochaetae0.711.101.590.740.841.040.130.360.250.69Desulfobacterobia0.590.710.430.280.510.490.060.160.320.35變形菌門Proteobacteria0.391.060.374.420.600.920.640.070.110.09Fibrobacterota0.210.240.500.190.200.250.050.200.160.43

由圖3-B和表6可知，在屬水平上，6個組的優勢菌屬均為普雷沃氏菌屬(Prevotella)、理研菌科RC-9腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)和norank_UCG-011，其相對豐度均在2%以上。在栓系飼養方式下，普雷沃氏菌屬的相對豐度隨飼糧能量水平的增加而升高，TH組的相對豐度顯著高于TM和TL組(P<0.05)；散欄飼養方式下，普雷沃氏菌屬的相對豐度各組間差異不顯著(P>0.05)。

表6 牦牛瘤胃菌群屬水平組成

3 討 論

3.1 飼養方式和飼糧能量水平對牦牛生長性能的影響

本試驗中，栓系組和散欄組牦牛的平均增重分別為58.73和67.87 kg，平均日增重分別為652.7和754.2 g/d，散欄組比栓系組高出15.6%。趙育國等[11]研究了栓系與散欄飼養方式對肉牛生長性能和營養物質表觀消化率的影響，結果顯示，與栓系組相比，散欄組肉牛采食量和日增重都有所提高。趙廣永[12]結合動物生理特點分析認為肉牛的栓系飼養不利于其生長發育，不利于其對飼料的消化吸收和自身機體在冬天的御寒保暖。

本試驗同時發現，在飼養的3個月中，各組牦牛的月增重均呈現先增加后降低的趨勢，第3個月的增重最低。分析原因可能是由于第1個月各組牦牛被分配到新的養殖環境中，對當地的養殖環境如海拔、溫度等表現出一定的應激，使得第1個月牦牛的增重小于第2個月；第2個月時牦牛已經適應了當地環境和飼糧結構，各組的整體增重高于第1個月，栓系組牦牛第1個月還保持著它原來的食欲，但在第2個月由于運動量減少，長時間導致胃腸蠕動減弱，消化代謝和吸收緩慢，第2個月散欄組的增重略高于栓系組；第3個月最冷，牦牛攝入的能量除了維持機體正常的生理活動，還需用于維持體溫的恒定和皮下脂肪的生成等，因此第3個月的增重最少。

A：門水平 phylum level。Bacteroidetes：擬桿菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Patescibacteria：桿狀菌門；Actinobacteria：放線菌門；Synergistetes：互養菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Spirochaetae：螺旋體門；Proteobacteria：變形菌門；Others：其他。

本試驗中，在栓系飼養方式下，牦牛的平均日增重隨著飼糧能量水平的升高而增加，各組間差異顯著，與Brown等[13]的研究結果一致；在散欄飼養方式下，隨著飼糧能量水平的升高，牦牛的平均日增重呈現出先增加后降低的趨勢，以CM組的平均日增重最高。結合前人的研究，分析其原因可能是栓系相當于限制了牦?；顒涌臻g，散欄牦牛采食后適當的運動更符合自然規律和動物機體生理條件，促進了牦牛對營養物質的消化吸收，因此散欄組的平均日增重優于栓系組。栓系組中，牦牛攝入的能量除了滿足機體的正常工作以外還需部分能量御寒并轉化為皮下脂肪，因此需攝入更多的能量，因此栓系組牦牛的平均日增重隨著飼糧能量水平的升高而增加；在散欄組中，牦牛適當的運動可以促進胃腸道的蠕動和對營養物質的消化與利用，同時適當的運動還會加速骨骼肌產生熱量用于抵御寒冷，因此適宜的飼糧能量水平就會產生較好的育肥效果，過高的飼糧能量水平反而會對消化代謝產生一定的負面影響，進而影響增重。

3.2 飼養方式和飼糧能量水平對牦牛瘤胃發酵參數的影響

瘤胃液pH對瘤胃微生物活動以及自身健康非常重要，是反映瘤胃發酵水平的綜合指標。正常情況下，反芻動物通過自身調節瘤胃內環境使瘤胃液pH維持在6～7的適宜范圍內[14]。飼糧的精粗比和營養水平是影響瘤胃液pH的主要因素。王鴻澤[15]在牦牛上的研究發現，將飼糧能量水平由5.32 MJ/kg降到3.72 MJ/kg，瘤胃液pH由6.75降到6.67。徐俊等[16]通過體外發酵試驗研究了不同飼糧中性洗滌纖維(NDF)水平對瘤胃發酵的影響，得到了36% NDF組瘤胃液pH顯著高于32% NDF組的結果。本試驗中，各組牦牛瘤胃液pH在6.34～6.78內隨著飼糧能量水平的增加而降低，這與前人的研究結果相一致，原因可能是較高能量水平飼糧的NDF和酸性洗滌纖維(ADF)含量較低。

NH3-N在瘤胃中的濃度保持著動態平衡，NH3-N濃度是評價瘤胃發酵的重要指標，其在一定程度上反映了反芻動物瘤胃內含氮物質的發酵和吸收速率[17]。研究表明，瘤胃液NH3-N濃度的適宜范圍為6～30 mg/dL[18]。本試驗中，各組牦牛瘤胃液NH3-N濃度均處在正常范圍之中。萬發春等[19]在利雜牛上的研究表明，隨著飼糧能量水平的增加，瘤胃液NH3-N濃度顯著降低。王斌星等[20]比較了不同能量水平飼糧對牦牛瘤胃發酵的影響，結果顯示，中能組牦牛瘤胃液中總揮發性脂肪酸(TVFA)濃度最高，NH3-N濃度最低。本試驗結果與王斌星等[20]的報道相一致，中能組牦牛瘤胃液NH3-N濃度低于低能組和高能組，說明中能組具有較其他2組更好的能氮平衡度，可促進微生物蛋白(MCP)的合成和氮的利用；此外，飼喂相同的中能量水平飼糧時，散欄飼養方式下牦牛瘤胃液NH3-N濃度要高于栓系飼養方式下牦牛，因此，散欄飼養方式下中能量組牦牛相比于其他組牦牛具有較好的育肥效果。

反芻動物的瘤胃微生物可將飼料中的纖維降解并轉化為揮發性脂肪酸，為機體提供70%～80%的能量需求[21]。瘤胃液中的乙酸、丙酸、丁酸是揮發性脂肪酸的主要成分[22]。Li等[23]在肉牛上的研究顯示，高能量水平飼糧降低了瘤胃液中乙酸的比例，提高了丙酸的比例。本研究結果顯示，隨飼糧能量水平的增加，牦牛瘤胃液丙酸濃度有所提高，與前人研究結果一致。這是因為低能量水平飼糧中，NDF和ADF的含量較高，非可溶性碳水化合物含量較高，瘤胃發酵產生的乙酸較多；本試驗中的能量飼料主要為玉米，玉米中含有較多的淀粉，高能量水平飼糧中玉米比例增加提高了淀粉的含量，淀粉屬于易消化的可溶性碳水化合物，此時瘤胃發酵產生的丙酸也相應增加。丙酸作為糖異生的主要來源，約有27%的葡萄糖源自丙酸合成，瘤胃液中丙酸濃度越高意味著反芻動物可以得到更多的能量用于生長。本試驗中，CM組瘤胃液丙酸濃度最高，說明CM組牦?？梢詮娘暭Z中得到更多的能量，因此CM組牦牛擁有最好的育肥效果。

3.3 飼養方式和飼糧能量水平對牦牛瘤胃菌群的影響

本研究通過Illumina HiSeq測序平臺研究了飼養方式和飼糧能量水平對牦牛瘤胃菌群的影響，試驗得到的稀釋曲線已到達平臺期，表明樣本的測序量和測序深度合理，測序結果可以進行后續的研究。

ACE和Chao1指數可反映微生物的豐度。在本試驗中，隨著飼糧能量水平的增加，栓系和散欄2種飼養方式下牦牛的ACE和Chao1指數均顯著降低。這說明不同的飼糧能量水平會影響牦牛瘤胃菌群的相對豐度，且飼糧能量水平的提高會降低瘤胃菌群的相對豐度，這與前人的研究結果[24]相符；但是Shannon和Simpson指數沒有顯著變化，這說明在栓系和散欄2種飼養方式下設計的飼糧能量水平差異沒有影響到牦牛瘤胃菌群的多樣性[25]。

對于反芻動物瘤胃菌群多樣性及結構特性，已有研究指出，擬桿菌門和厚壁菌門是瘤胃菌群中占比最高的門分類細菌[26]。本試驗中共有24個門被鑒定出，以擬桿菌門、厚壁菌門和桿狀菌門3個優勢菌門為主導，各菌門在各組間的相對豐度也有所不同。擬桿菌門作為第1優勢菌門在栓系組中的相對豐度為50.44%，顯著高于散欄組中的43.50%，推測可能是由于栓系限制了牦牛的自由活動，使得牦牛胃腸道的蠕動及對營養物質的消化吸收速率減慢，擬桿菌門作為瘤胃中的主導菌門，因此就需要相對豐度更高的擬桿菌門參與此過程。

在栓系飼養方式下，擬桿菌門的相對豐度隨著飼糧能量水平的升高而增加；在散欄飼養方式下，擬桿菌門的相對豐度隨飼糧能量水平的升高呈現出先增加后降低的趨勢。分析原因可能是因為高能量水平飼糧中玉米所占的比例較高，擬桿菌門的主要作用是與復雜的大分子物質相結合，將復雜的大分子有機物降解，如將碳水化合物降解為單糖等，因此在栓系條件下擬桿菌門的相對豐度隨著飼糧能量水平的增加而升高；散欄飼養的牛擁有良好的自由活動空間，活動量的增加加快了其對營養物質的吸收利用，因此散欄飼養方式下牦牛的育肥效果更佳，但過高的飼糧能量水平也會對動物的消化和代謝產生一定的負面影響，進而影響增重，因此散欄飼養方式下高能組擬桿菌門的相對豐度就略低于中能組和低能組。

本試驗在屬水平上共有377個菌屬被鑒定出，普雷沃氏菌屬和理研菌科RC-9腸道群是已知分類菌屬中占比最高的菌屬(二者相對豐度之和約占28%)，克里斯滕森菌科R-7群和norank_UCG-011的相對豐度也均在2%以上。張紅濤[27]研究荷斯坦后備牛瘤胃菌群組成時發現，普雷沃氏菌屬和琥珀酸菌屬是瘤胃中的優勢菌屬。高雨飛等[28]通過測序發現錦江牛瘤胃細菌在屬水平上的優勢菌屬是普雷沃氏菌屬、帕拉普氏菌屬。本試驗結果與前人的不完全一致，推測原因可能是由于品種、年齡、飼糧營養水平、飼養管理等不同導致的，但通過上述研究結果可知普雷沃氏菌是反芻動物瘤胃中廣泛存在和數量最多的菌屬，與Sharma等[29]的研究結果一致。在本試驗中，栓系組普雷沃氏菌屬的相對豐度隨飼糧能量水平的升高而增加，分析原因可能是由于本試驗飼糧配方中的能量飼料主要為玉米，玉米在畜牧業生產中被大量利用的主要原因是玉米中的淀粉含量較高，有研究表明可分離培養的普雷沃氏菌中，一部分具有降解蛋白質和淀粉的功能；另一部分具有發酵纖維二糖、葡萄糖和果糖的能力[30]，因此在栓系組中普雷沃氏菌屬的相對豐度隨能量水平的升高而增加。在散欄組中，活動量的增加使得營養物質可以更好地被吸收利用，育肥效果更佳，但過高的飼糧能量水平也可能對牦牛的消化功能產生一定的負面影響，因此散欄飼養方式下高能組普雷沃氏菌屬的相對豐度低于中能組。

4 結 論

不同飼養方式和飼糧能量水平會對牦牛生長性能、瘤胃發酵參數和瘤胃菌群組成產生一定的影響，總體上散欄飼養方式優于栓系飼養方式。綜合本試驗所得結果，散欄飼養方式下飼糧NEmf為6.22 MJ/kg時是較適宜進行牦牛冷季育肥的條件。